Идентификация культуры по биохимической активности. Техника посева культуры на ЖПС

1.

Идентификация культуры по
биохимической активности.
Техника посева культуры на ЖПС

2.

Контрольные вопросы
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Цель 3 этапа; Манипуляции. Идентификация (идентификационные
тесты - перечислить)
Ферменты.
Метаболизм (ассимиляция, диссимиляция).
Дыхание. Типы дыхания (аэробы, анаэробы).
Размножение микробных клеток.
Этапы размножения на ЖПС.
Сахаролитические ферменты (что расщепляют). Промежуточные и
конечные продукты расщепления.
Среды Гисса. Короткий ряд, «работа».
Протеолитические ферменты. Субстрат. Промежуточные и конечные
продукты.
Индикаторы на сероводород, индол. Как изменяется их цвет?
Оксиредуктазы. Назначение.
Ферменты вирулентности или патогенности
Эндо и Экзотоксины. характеристика. Чем представлен. Какой из
них обезвреживается формалином.
Пигменты. Назначение.
Среды Ресселя и Олькеницкого: назначение, состав, изменение сред
при накоплении чистой культуры

3.

Б/Х свойства микроорганизмов
• Определяются набором ферментов,
участвующих в метаболизме.
Ферменты – в-ва белковой природы, кот.
являются катализаторами обменных
процессов .
Катализатор - в-во, ускоряющее химическую
реакцию
Б/Х св-ва можно изучить на популяции м/о
(это организмы одного вида, обитающие в
одном месте)

4.

Метаболизм (обмен веществ) бактерий представляет
собой совокупность двух взаимосвязанных противоположных процессов
катаболизма и анаболизма.
Катаболизм (диссимиляция) – распад в-в в процессе ферментативных
реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ.
Анаболизм (ассимиляция) – синтез в-в с затратой энергии.
Особенности метаболизма у бактерий состоят в том, что:
• его интенсивность имеет достаточно высокий уровень.
• процессы диссимиляции преобладают над процессами ассимиляции;
• субстратный спектр потребляемых бактериями веществ очень широк –
от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических
соединений, включая антропогенные вещества – загрязнители
окружающей среды (обеспечивая тем самым процессы ее
самоочищения);
• бактерии имеют очень широкий набор различных ферментов – это
также способствует высокой интенсивности метаболических
процессов и широте субстратного спектра.

5.

6 классов ферментов
1. Оксиредуктазы
участвуют в процессе
дыхания
2. Гидролазы - расщепляют У.Б.Ж.
3. Трансферазы осуществляют
межмолекулярный перенос хим. групп от
одних соединений к другим
4. Изомеразы внутримолекулярное
перемещение хим. групп
5. Лиазы катализируют р-ции путем
присоединения или отрыва двух связей, но
без присоединения воды или окисления).
6. Лигазы катализируют процессы синтеза
связей за счет энергии расщепления
пирофосфатных связей в молекуле АТФ).

6.

Гидролазы
Сахаролитические ферменты Протеолитические
1. Сахаролитические
расщепление у/в :
лактоза
1. промежуточный: альдегид
глюкоза
или кислота – ведет к
мальтоза
до
снижению рН
маннит
2. при глубок.ферментации
сахароза
промежут.продукты - до
крахмал и др.
СО2 и Н2О

7.

Питательные среды
• Среда Гисса
Каждая среда среда содержит : пит.основу –
жидкую или п/жид. ; 1 у/в ;индикатор,
улавливающий изменение рН.
• Наиболее часто используют 5 сред – короткий
ряд Гисса = пестрый ряд
ЖПС в нее опускают
• лактоза
поплавок для
• глюкоза
улавливания газа
• мальтоза
• маннит
• сахароза

8.

Работа сред Гисса
фермент
у/в
кислота
Изм. цвета
индикатора
сниж.рН
Изм. цвета
среды
Глубокая ферментация
фермент
кислота
СО2+Н2О
ГАЗ В
ПОПЛАВКЕ
ИЛИ В СРЕДЕ

9.

2. Протеолитические ферменты – это ферменты,
расщепляющие белки до АК. При глубокой
ферментации образуется : сероводород
(ферментация серосодержащих АК),
индол (при ферментации триптофана)
может образ. мочевина аммиак
Изучают на средах с желатином, молоком,
сывороткой, пептоном

10.

• Наиболее часто изучается Н2S и индол.
Питательные среды
Бульон Хоттенгера /яичный белок, молочный агар,
свернутая сыворотка, желатин.
Действие ферментов определяют по разжижению
среды.
Глубокую ферментацию АК до Н2S и индола изучают с
помощью индикатора.
Н2S – ацетат
свинца
бесцветный
чернеет
Индолщавелевая
к-та
бесцветный
розовеет

11.

12.

Окислительно-восстановительные ферменты
Редуктазы участвуют в процессах «дыхания» т.е
катализируют б/х процессы.
Питательные среды с индикаторами:
Молоко с метиленовым синим : если
редуктаза+ кремовый цв.среды
Лакмусовое молоко (ср.Минкевича): если
Окислительные ф-ты(аэробы), то среда розовеет
Восстановительные ф-ты, то среда синеет

13.

14.

П/жидкие ПС Ресселя и Олькеницкого
Назначение : накопление чистой культуры и ее
дифференциация по б/х свойствам.
При
Применяется на 2 эт Бак. метода.
глубокой
Техника посева : газоном по скосу , с
фермента
ции У –
последующим уколом в столбик.
пузырьки
или
разрыв
среды

15.

Среда Ресселя – двусахарный агар
Состав: лактоза, глюкоза +
индикатор
Работа среды :
Глюкоза ферм-ся в анаэробных условиях = столбик
Лактоза ферм-ся в аэробных условиях = скос
Накопление чистой к-ры, ферментирующей глюкозу
изменяется цвет столбика
Накопление чистой к-ры, ферментирующей лактозу
изменяется цвет скоса
Накопление чистой к-ры, ферментирующей
глюкозу + лактозу
изменение цвета всей среды

16.

Среда Олькеницкого – трехсахарный агар
Состав: пит.основа, лактоза,
глюкоза, сахароза +
2 индикатора (на у/в + на Н2S)
Работа среды:
Накопление чистой к-ры, ферментирующей глюкозу
и сахарозу изменяется цвет
столбика
Накопление чистой к-ры, ферментирующей лактозу
изменяется цвет
скоса
При образовании Н2S
почернение по ходу укола

17.

Протокол № 9
Тема: Работа с чистой культурой. Идентификация
культуры по биохимической активности.
Техника посева чистой культуры на жидкие и
полужидкие питательные среды.

18.

1. Оценить рост на скошенном агаре
• На скошенном МПА
энтеропатогенные кишечные
палочки образуют влажный
блестящий сероватый налет.
• На среде Олькеницкого киш.палочка
вызывает изменение цв.среды, как
в столбике, так и на скосе,
наблюдаются разрывы среды
пузырьками газа (ферментация
лактозы и глюкозы до кислоты и газа).

19.

2. Определить чистоту накопленной культуры
Возможны 2 варианта:
1)Мазок по Граму: Гр – мелкие
палочки с закругленными краями
(зарисовать красным карандашом)
2) Тест Грегерсона.
а) На середину предметного стекла нанести каплю КОН
б) Стерильной остуженной петлей внести чистую культуру в
каплю.
в) Растереть бак.петлей
культуру со щелочью
периодически приподнимая
петлю
Гр- микроорганизмы дают
ослизнение (за петлей тянется конус слизи)

20.

3. Посев чистой культуры на среды Гисса
Короткий ряд Гисса включает 5 сред с глюкозой, лактозой, мальтозой,
маннитом и сахаразой. Среда с маннитом – полужидкая.
1. Прожигают бак. петлю перед каждым посевом на
питательную среду.
2 В левую руку берут пробирку с исслед.м-лом. Пробирку
зажимают большим и указательным пальцами. Для
того, чтобы можно было наблюдать за содержанием
пробирок, их держат сверху кисти руки. Пробирки
должны быть наклоненными.
3. Пробку из пробирки вынимают, держа ее 4 и 5
пальцами правой руки. Тремя другими пальцами
правой руки, как карандаш, держат бактериологическую
4. Пробирки открывают и край их проносят через пламя
горелки. Петлю опускают в пробирку, где есть
исследуемый материал, и, охлаждают, касаясь стенки.

21.

5. В последующем петлю опускают в пробирку и набирают
материал. Когда используют микроорганизмы, которые
выросли на поверхности среды, осторожно плавным
движением набирают небольшое количество их, следя,
чтобы не повредить питательную среду.
6. Петлю вынимают из пробирки, пробки и края пробирок
проносят через пламя и закрывают.
7. В левую руку берут пробирку со средой Гисса.
открывают и край ее и пробку проносят через пламя
горелки .
8. Петлю с материалом окунают в жидкость. Если он не
снимается из петли, его осторожно растирают на
стенке пробирки и омывают средой.
9. Край пробирки и пробку проносят через пламя и
закрывают пробирку
10. Петлю прожаривают в пламени, чтобы уничтожить
микроорганизмы.

22.

• При посеве уколом в столбик
питательной среды пробирку с МПА,
желатином и тому подобное берут в левую
руку, петлю с материалом – в правую и
делают укол к дну пробирки в среду. Петлю
осторожно вынимают, а пробирку
закрывают.