Пластический метаболизм. Использование биохимических свойств микроорганизмов для их дифференцирования и систематики

1.

Тема: ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Пластический метаболизм
Использование биохимических
свойств микроорганизмов для их
дифференцирования и
систематики

2. Метаболизм у прокариот

Метаболизм
Амфиболизм –
образование
промежуточных
продуктов (амфиболитов)
Пластический
обмен
Ферменты
Энергия
Энергетический
обмен

3. Overview of cell metabolism

4.

Пластический обмен - это
совокупность химических
процессов
направленных на
образование и обновление
структурных частей клеток
микроорганизмов.
Пластический обмен
называют анаболизмом.

5.

Виды пластического обмена у
прокариот
1. БЕЛКОВЫЙ
2. УГЛЕВОДНЫЙ
3. ЛИПИДНЫЙ
4. НУКЛЕИНОВЫЙ
5. МИНЕРАЛЬНЫЙ

6. Биосинтез белка

важнейший процесс в живой природе.
Это создание молекул белка на основе
информации о последовательности
аминокислот в его первичной структуре,
заключенной в структуре ДНК
Необходимые компоненты:
рибосомы,
энергия АТФ,
аминокислоты,
ферменты,
различные виды РНК

7. БЕЛКОВЫЙ ОБМЕН

ВКЛЮЧАЕТ катаболизм и анаболизм
КАТАБОЛИЗМ:
Ионы аммония
БЕЛОК
АК
ПРОТЕАЗЫ
ПЕПТИДАЗЫ
АК
ПЕПТИД
ПЕПТИД
ПЕПТИД
АК
АК
Синтез
основных АК
прокариот

8. Основные аминокислоты синтезируемые прокариотами

• Аланин A Ала
• Аргинин R Арг
• Аспарагиновая кислота
D Асп
• Аспарагин N Асн
• Валин V Вал
• Гистидин H Гис
• Глицин G Гли
• Глутаминовая кислота E
Глу
• Глутамин Q Глн
Изолейцин I Иле
Лейцин L Лей
Лизин K Лиз
Метионин M Мет
Пролин P Про
Серин S Сер
Тирозин Y Тир
Треонин T Тре
Триптофан W Три
Фенилаланин F Фен
Цистеин C Цис
Ведущими из них являются АЛАНИН, ГЛУТАМИН, АСПАРАГИН

9. Рибосомы состоят из нескольких десятков белков и рРНК. У бактерий они мельче (70S), у эукариот – 80S

Большая
субъединица
Условное изображение рибосомы. Р и А –
пептидильный и аминоацильный участки
Малая
субъединица

10.

Трансляция у прокариот
- Инициация (начало считывания, при инициации
рибосома состоит из большой и малой
субъединиц, которые соединены в области
инициации трансляции (translation initiation region
-TIR) mRNA)
- Элонгация (во время элонгации рибосома
скользит вдоль mRNA и синтезирует
полипептидную цепь. Элонгация продолжается до
тех пор, пока рибосома не достигает стоп-кодона
на mRNA)
-Терминация (рибосома отделяется от
синтезированного полипептида и способна снова
повторить цикл трансляции mRNA

11. Трансляция у прокариот

12. По одной мРНК могут перемещаться несколько рибосом друг за другом – так синтезируется больше белка

13. Процессинг белка В ходе трансляции образуется первичная структура белка. Затем белок приобретает вторичную, третичную и четвертичную стр

Процессинг белка
В ходе трансляции образуется первичная
структура белка. Затем белок
приобретает вторичную, третичную и
четвертичную структуру

14. Фолдинг – сворачивание, приобретение белком его окончательной структуры

15.

16. Нуклеиновый обмен у прокариот связан с генетическим обменом

1. Синтез НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ имеет
значение для процесса деления клетки
2. Принимают участие ферменты:
• рестриктазы (вырезают участки ДНК, убирая
нежелательные вставки),
• ДНК-полимеразы (ответственны за репликацию
дочерней ДНК по материнской),
• лигазы (обеспечивают сшивку фрагментов НК),
• ДНК-зависимые РНК-полимеразы
(осуществляют построение РНК на матрице ДНК)

17.

18.

Транскрипция - синтез РНК
по матрице ДНК
В качестве матричной выступает
цепь ДНК 3’ 5’.
Цепь 5’ 3’ в транскрипции не
участвует. Эту цепь называют
кодогенной, т.к.
последовательность нуклеотидов
РНК (кодонов) совпадает с ее
последовательностью
В ТРАНСКРИПЦИИ различают:
1. Начало – инициацию
2. Удлинение цепи РНК –
элонгацию
3. Окончание - терминацию

19. Инициация транскрипции: фермент РНК-полимераза связывается с промотором на одной из цепей ДНК. (РНК-полимераза I и III транскрибируют гены т-

1.
Инициация транскрипции: фермент РНКполимераза связывается с промотором на
одной из цепей ДНК.
(РНК-полимераза I и III транскрибируют гены т- и
р-РНК; РНК-полимераза II – гены белков)
5
3
3
5
промотор
РНК-полимераза
ДНК

20. 2. Элонгация – по принципу комплементарности и антипараллельности на матричной цепи ДНК строится РНК- копия

2. Элонгация – по принципу
комплементарности и антипараллельности
на матричной цепи ДНК строится РНКкопия
кодогенная цепь
матричная цепь

21. 3. Терминация. Сигналом для этого служит образование «шпильки» на РНК, при этом РНК отсоединяется от ДНК

Сигнал терминации
РНК
Самопроизвольное
сворачивание
«шпилька»

22. В ОТЛИЧИЕ ОТ ЭУКАРИОТ У ПРОКАРИОТ НОВАЯ СИНТЕЗИРОВАННАЯ МОЛЕКУЛА РНК НЕ ВСТУПАЕТ В ПОСТТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС - ПРОЦЕССИНГ ИЛИ СОЗРЕВАН

В ОТЛИЧИЕ ОТ ЭУКАРИОТ У
ПРОКАРИОТ НОВАЯ
СИНТЕЗИРОВАННАЯ МОЛЕКУЛА
РНК НЕ ВСТУПАЕТ В
ПОСТТРАНСКРИПЦИОННЫЙ
ПРОЦЕСС - ПРОЦЕССИНГ ИЛИ
СОЗРЕВАНИЕ РНК

23. У прокариот транскрипция (1) и трансляция (2) не разделены ни в пространстве, ни во времени

прокариотическая клетка
3’
рибосомы
(1)
Кольцевая
ДНК
5’
(2)
белок

24. ЛИПИДНЫЙ ОБМЕН У ПРОКАРИОТ

КАТАБОЛИЗМ:
1. Принимают участие
ферменты:
липопротеиназы,
лецитиназы, липазы,
фосфолипазы
2. При распаде ЖК клетка
запасает энергию
3. Конечным продуктом
распада является
АЦЕТИЛ-КоА
АНАБОЛИЗМ:
участвуют
ацетилпереносящие белки
– переносят ацетильные
группы на глицерофосфат
ФОСФАТИДНЫХ КИСЛОТ
СЛОЖНЫЕ ЭФИРЫ И
СПИРТЫ
ФОСФОЛИПИДЫ ЦПМ

25. УГЛЕВОДНЫЙ ОБМЕН У ПРОКАРИОТ

В углеводном обмене у прокариот катаболизм
ПРЕОБЛАДАЕТ над анаболизмом
МОНОСАХАРА
ПОЛИСАХАРИДЫ
ДИСАХАР
ДИСАХАР
ДИСАХАР
В КЛЕТКУ МОЖЕТ
ПОСТУПАТЬ ТОЛЬКО
ДИСАХАР
ГЛЮКОЗА

26.

1 ПУТЬ: синтез
ГЛЮКОЗА
СИНТЕЗ СОБСТВЕННЫХ
ПОЛИСАХАРИДОВ
КЛЕТКИ
2 ПУТЬ:
дальнейшее
расщепление
АНАЭРОБНЫЙ РАСПАД –
БРОЖЕНИЕ (ГЛИКОЛИЗ)
АЭРОБНЫЙ РАСПАД
–
В зависимости от конечных продуктов
различают виды брожения:
1. СПИРТОВОЕ (эукариоты - грибы);
2. ПРОПИОНОВО-КИСЛОЕ (клостридии,
пропиони-бактерии);
3. МОЛОЧНО-КИСЛОЕ (стрептококки);
4. МАСЛЯНО-КИСЛОЕ (сарцины);
5. Бутилденгликолевое (бациллы).
У прокариот могут
встречаться
дополнительные пути
расщепления углеводов:
ПЕНТОЗОФОСФАТНЫЙ,
КЕТОДЕЗОКСИФОСФОГЛЮКОНАТНЫЙ И ДР. Они
отличаются ключевыми
продуктами и реакциями

27. МИНЕРАЛЬНЫЙ ОБМЕН

Важен для синтеза органических соединений
прокариот
ОРГАНОГЕННЫЕ
:
МАКРОЭЛЕМЕНТЫ:
С, О, N, H
ЗОЛЬНЫЕ
МАКРОЭЛЕМЕНТЫ:
S, P, K, Ca и др.
МИКРОЭЛЕМЕНТЫ:
B, Mo, Zn, Mn, Co, Ni,
I, Br, Cu и др.
Например: сера в составе R-SH входит в состав цитоплазмы и регулирует все
ОX-RED реакции; фосфор входит в состав НК, многих ферментов,
фосфолипидов, через АТФ и АДФ-кислоты участвует в энергетическом
обмене клеток

28. Ферменты бактерий

• Синтезируются самой клеткой
• Обладают высокой активностью
• Специфичностью (ценное
диагностическое значение)
• Имеют сложное строение:

29.

Классификация ферментов
- по строению:
простые: белки с высокой молекулярной массой (пепсин, трипсин);
сложные: белковая часть- апофермент + кофактор (Ме, витамины).
Кофактор,прочно связанный с белком, называют простетической группой. (биотин,
тиамин итд.)
- по месту действия:
● Эндоферменты катализируют метаболизм внутри клетки.
● Экзоферменты выделяются клеткой в окружающую среду, расщепляя
макромолекулы питательных субстратов до простых соединений, которые
усваиваются клеткой.
Могут инактивировать антибиотики (пенициллиназа и др.), выполняя защитную
функцию
Различают:
● конститутивные
ферменты - синтезируются непрерывно, независимо от
наличия в питательной среде субстрата;
● индуцибельные
(адаптивные) ферменты - синтезируются только при наличии
в среде субстрата данного фермента;
● репресибельные ферменты– синтез подавляется избытком продукта реакции.

30.

- по типу реакций, которые они катализируют:

31.

Ферменты патогенности: нейраминидаза,
гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, ДНК-аза,
протеаза, фибринолизин
Прикладное значение ферментов
В генной инженерии и генодиагностике:
рестриктазы (эндонуклеазы), ДНК-синтетазы, ДНКполимераза, обратная транскриптаза
Для идентификации – сахаролитические,
протеолитические, ферменты патогенности,
оксидоредуктазы, аутолитические ферменты
В медицине – стрептокиназы, стрептодорназы.

32.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ МЕТОД
ИССЛЕДОВАНИЯ
«золотой стандарт»
диагностики ИНФЕКЦИОННЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ, так как
результаты
микробиологических
исследований позволяют точно
установить факт наличия
возбудителя в исследуемом
материале пациента

33.

Задачи КУЛЬТУРАЛЬНОГО
метода исследований
1. Идентифицировать
микроорганизмы в исследуемом
материале
2. Определить их видовую
принадлежность по
морфологическим, биохимическим,
токсигенным, антигенным и др.
свойствам
3. Установить чувствительность к
антимикробным препаратам (АМП)

34. Применение культурального метода

• В клинической медицине: для диагностики
инфекционных заболеваний
• В эпидемиологии: для определения
микробоносительства и для выявления
источника инфекции
• В санитарной микробиологии: для
определения патогенных микроорганизмов
во внешней среде и определения
санитарного состояния объектов внешней
среды.

35.

Задание 2. Разобрать основные
этапы культурального метода
исследования и записать в тетрадь
протокол исследования

36.

1 ЭТАП: ПОСЕВ ИССЛЕДУЕМОГО
МАТЕРИАЛА
• Подготовка исследуемого материала к
посеву
•Посев исследуемого материала на плотные
питательные среды (для получения
изолированных колоний) и на жидкие
питательные среды (среды обогащения)
•В отдельных случаях проводится
микроскопия нативного материала

37.

2 ЭТАП: ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ
КУЛЬТУРЫ
• Изучение колоний, выросших на
плотных питательных средах
• Приготовление мазков из
выросших колоний для изучения
морфологических и
тинкториальных свойств
микроорганизмов
• Выделение чистой культуры
• При отсутствии роста на плотных
питательных средах пересев со
сред обогащения на плотные
питательные среды

38.

3 ЭТАП: ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ
ВЫДЕЛЕННОЙ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ
МИКРООРГАНИЗМА
1. Изучение характера роста чистой
культуры
2. Приготовление и микроскопия мазков
для проверки чистоты культуры
3. Изучение культуральных,
биохимических, серологических свойств
выделенного микроорганизма
4. Определение чувствительности
выделенного микроорганизма к АМП

39.

4 ЭТАП. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДА
ВЫДЕЛЕННОГО МИКРООРГАНИЗМА И
ВЫДАЧА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО
ЗАКЛЮЧЕНИЯ
• Учет результатов изучения культуральных,
биохимических, серологических свойств
выделенного микроорганизма
• Определение вида возбудителя
• Учет результатов определения
чувствительности выделенного
микроорганизма к АМП и бактериофагам
• Выдача бактериологического заключения

40. Протокол исследования

Метод исследования
Культуральный
Исследуемый материал
Гнойное отделяемое раны
Цель исследования
Выделить чистую культуру и определить
видовую принадлежность возбудителя
1 этап исследования
Посев материала методом
истощающего штриха на МПА
2 этап исследования
3 этап исследования
4 этап исследования

41. Свойства микроорганизмов, используемые для их идентификации

• Морфологические признаки – форма, размеры и
взаиморасположение микробных клеток, изучаемые
микроскопическим методом исследования
• Тинкториальные признаки – способность микробных
клеток окрашиваться красителями, изучаемые
микроскопическим методом исследования
• Культуральные признаки – характер роста на жидких и
плотных питательных средах
• Биохимические (ферментативные) признаки –
способность микроорганизмов расщеплять различные
субстраты
• Антигенные признаки – определение специфических
антигенов с использованием серологических реакций
• Фаголизабельность – разрушение микробной клетки
специфическим бактериофагом
• Выделение биологически активных веществ –
определение факторов патогенности микроорганизмов

42.

КОЛОНИЯ – это видимое изолированное скопление
представителей одного вида микроорганизмов,
образующееся при размножении одной
колониеобразующей единицы (КОЕ) на плотной
питательной среде (на ее поверхности или в глубине)

43. СВОЙСТВА МИКРОБНЫХ КОЛОНИЙ

• по величине — крупные (диаметр более 4—5 мм), средние
(2—4 мм) и малые (1—2 мм)
• по форме — круглые, розеткообразные, листовидные и т. д.
• по цвету, зависящему от пигмента — белого, ярко-синего,
красного цветов и т. д.
• по консистенции — сухие, влажные, сочные, слизистые
• по поверхности — гладкие, морщинистые, исчерченные,
плоские, выпуклые, плосковыпуклые, вдавленные
• по краю — с ровными, волнистыми, бахромчатыми краями
• по структуре — могут иметь аморфную, зернистую,
волокнистую внутреннюю структуру
• в чистой культуре, выращенной на скошенном питательном
агаре, характер роста может быть сухим, влажным,
ползучим, складчатым, пигментированным.

44.

Характер роста на плотной питательной среде
Форма
колонии
Поверхность
колонии
Края колонии

45.

Типы микробных колоний
• S тип колоний [от англ. Smooth – гладкий]
характеризуется круглой, выпуклой и
правильной формой, гладкой поверхностью,
влажной консистенцией.
• R тип колоний [от англ. Rough- шероховатый]
характеризуется шероховатой поверхностью,
неправильными краями, сухой
консистенцией.
• М тип колоний [от англ. Mucoid - слизистый]
• D тип колоний [от англ. dwar карликовый]

46.

ПРИЗНАКИ РОСТА КУЛЬТУР НА ЖИДКОЙ
ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ
• Диффузное помутнение
• Образуют придонный или
пристеночный рост
• Образуют пленки на
поверхности среды или осадок
на дне пробирки

47.

• Задание 3. Изучить культуральные свойства
бактерий при росте на твердых питательных
средах используя рисунок 1 - 7.
Рис. 1.

48. РИС. 2

49. Рис. 3.

50. Рис. 4.

51. Рис. 5.

52. Рис. 6.

53. Рис. 7.

54.

Задание 4. Определить характер роста
микробных культур на жидких питательных
средах и зарисовать в тетрадь
А
1
2
1 – ПРОБИРКА С КУЛЬТУРОЙ; 2 – КОНТРОЛЬНАЯ ПРОБИРКА

55.

Б
В

56. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Важным диагностическим признаком при
идентификации микроорганизмов являются
биохимические свойства бактерий, которые
определяются составом ферментов:
• сахаролитические –расщепление углеводов;
• протеолитические – расщепление белков;
• липолитические – расщепление жиров.

57. Определение спектра сахаролитической активности микроорганизмов («Пестрый ряд»)

В тесте
используется:
жидкие сахара,
индикатор рН и
стеклянный
поплавок
Принцип действия: при
ферментации углевода
образующиеся кислые
продукты меняют рН, при
этом изменяется окраска
индикатора, а при
выделении СО² он
собирается в поплавке
Применяется для
обнаружения некоторых
патогенных и
факультативно-патогенных
микроорганизмов

58. Задание. 3. Разобрать и записать «пестрый ряд» на примере возбудителя БРЮШНОГО ТИФА

59. Состав: 1 % лактоза, 0,1% глюкоза, тиосульфат натрия и сульфат железа, индикатор фенол рот. Посев по поверхности и уколом в столбик агара. Учет р

Среда Клиглера:
Состав: 1 % лактоза, 0,1%
глюкоза, тиосульфат натрия
и сульфат железа,
индикатор фенол рот.
Посев по поверхности и
уколом в столбик агара.
Учет результата:
При ферментации только
глюкозы – желтый столбик,
скошенная часть не меняет
окраску.
При ферментации и
глюкозы, и лактозы (E.coli) –
весь агар желтый
При образовании
сероводорода
(сальмонеллы, протей) –
агар чернеет

60.

Среда Эндо
Состав: мясопептонный агар,
лактоза,фуксин,сульфит натрия (Na2SO3),
Принцип действия: фуксин
обесцвечивается сульфитом натрия
(образуется бесцветная фуксинсернистая
кислота);
Учет результата:
Энтеробактерии, сбраживающие лактозу,
в процессе брожения выделяют
муравьиную кислоту, которая дает цветную
реакцию с реактивами на альдегиды, в том
числе и с фуксинсернистой кислотой с
образованием свободного фуксина, в
результате чего их колонии окрашиваются в
E. coli
малиново-красный цвет с металлическим
ферментирует
блеском или без него.
лактозу
Колонии бактерий, не сбраживающих
лактозу, имеют белый или слабо-розовый
цвет (цвет питательной среды).
Salmonella и Shigella
не способны ферментировать
лактозу

61. Среда Плоскирева

Селективная среда для выделения
шигелл и сальмонелл.
В состав входят ингибирующие
вещества (желчные соли,
бриллиантовый зеленый, йод),
вследствие чего она должна полностью
подавлять рост грамположительной
флоры, значительно задерживать
(первые 24 ч) рост эшерихий и другой
сопутствующей микрофлоры, подавлять
роение протея.
Дифференцирующие свойства агара
Плоскирева основаны на изменении рН
в кислую сторону при росте
лактозоферментирующих бактерий,
которые образуют колонии брусничного
цвета (индикатор нейтральный красный).
Лактозоотрицательные бактерии
вырастают в виде бесцветных или
слабоокрашенных колоний.

62. Среда Симмонса

Тест, указывающий на
способность бактерий
использовать цитраты в
качестве единственного
источника углерода.
Применяют для
идентификации и
дифференциации
ENTEROBACTERIACEA.
Появление роста и изменение
цвета среды на синий дает
основание считать пробу
положительной, отсутствие
роста и изменения цвета отрицательной.

63. Определение протеолитической активности прокариот

ТЕСТ С ЛАКМУСОВЫМ МОЛОКОМ
Тест позволяет
определить не
только способность
прокариот
расщеплять белки,
но и степень
выраженности их
протеолитической
активности по «+++
системе»

64. Тест на образование индола

ИНДОЛ тест (INDOL test) предназначен для
быстрого определения образования индола в
результате утилизации триптофана бактериями,
обладающими триптофаназной активностью, в
частности, E. сoli, для разделения
индолположительных и индолотрицательных
штаммов
Принцип дейсвтия:
Происходит гидролиз триптофана на индол,
пировиноградную кислоту и аммиак.
Образовавшийся индол реагирует с парадиметиламиноциннамальдегидом (DMACA),
содержащимся в диагностической зоне полоски, с
развитием сине-зеленой окраски.
Реакция
Цвет
Положительная
Сине-зеленая
Отрицательная
Розовая, красная

65.

ПИГМЕНТООБРАЗОВАНИЕ
происходит при хорошем доступе кислорода и определенном составе
питательной среды. Этот признак генетически детерминирован, поэтому
его используют в качестве дифференцирующего критерия.
Бактерии могут образовывать пигменты разного
цвета:
• красный — Serratia marcescens
• кремовый — Staphilococcus aureus
• синий —Pseudomonas aeruginosa
Пигменты бактерий
- защищают их от природной
ультрафиолетовой
радиации,
- участвуют в процессах
дыхания, реакциях синтеза,
- обладают антибиотическим
действием.

66.

ПИГМЕНТООБРАЗОВАНИЕ у бактерий
Serracia marcescens
Pseudomonas aeruginosa
Staphilococcus aureus

67.

Определение факторов патогенности
микроорганизмов
Тест на способность выделять мембранотоксины – гемолизины
Различают: α – частичный гемолиз, β – полный гемолиз,
γ – визуально не обнаруживаемый гемолиз

68. Задание. Определите и зарисуйте основные виды гемолиза

А
Б
в
Г

69. Тест на ДНКазу - ДНКазу секретирует большинство патогенных микроорганизмов. Она способна разрушать НК клеток человека

ДНКаза положительные колонии
Используется
ДНКазный агар с
толуидиновым
синим. Колонии
способные
секретировать
ДНКазу образуют
вокруг себя
«мутный венчик»

70. Определение липолитической активности прокариот

Тест на
лецитовителазу
Лецитовителазоположительные колонии
S. aureus
ПРИНЦИП: Лецитовителаза
расщепляет лецитин –
фосфатид, содержащийся в
каждой клетке эукариот в виде
фосфолипидного слоя клеточных
мембран и митохондрий.
Микроорганизмы,
продуцирующие этот фермент,
способны повреждать клетки и
длительно персистировать в
организме человека.
Лецитовителазо «+» колонии
образуют на плотной среде
«венчик»

71. Задание. Разберите и нарисуйте лецитовителазную активность у представителей рода Bacillus

Б
А
В
(сектор А и В - Bacillus anthracis, сектор Б – Bacillus cereus)

72.

СПАСИБО
ЗА ВНИМАНИЕ