Ферментативные свойства микроорганизмов

1. Тема: Ферментативные свойства микроорганизмов

2. МЕТАБОЛИЗМ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ. Mеханизмы проникновения веществ в клетку.

Существует два типа переноса веществ в бактериальную клетку:
- пассивный;
- активный.
При пассивном переносе вещество проникает в клетку только по
градиенту концентрации. Затрат энергии при этом не
происходит.
Различают две разновидности пассивного переноса:
- простая диффузия (неспецифическое проникновение веществ в
клетку, при этом решающее значение имеет величина молекул
и липофильность. Скорость переноса незначительна);
- облегченная диффузия (осуществляется за счет особенных
белков - пермеаз, которые содержатся в цитоплазматической
мембране. Этот процесс также не требует энергетического
обеспечения. Скорость этого переноса зависит от
концентрации вещества в наружном слое).

3. Облегченная диффузия

4.

Активный транспорт.
Его также обеспечивают белки-пермеазы, они являются
высокоспецифическими и способны переносить только
определенные субстраты. Этот процесс происходит за счет энергии,
которую генерирует клетка, потому возможен перенос против градиента
концентрации.
Два типа активного транспорта:
1. Небольшие молекулы (аминокислоты, некоторые сахара)
«накачиваются» в клетку в концентрации в 100—1000 раз выше, чем
снаружи клетки.
2. Транслокация радикалов - включение в клетку некоторых сахаров
(например, глюкозы, фруктозы), которые в процессе переноса
фосфорилируются, т. е. химически модифицируются с помощью
специальной фосфотрансферной системы, составной частью которой
является белок-переносчик.
Выделяют также механизм ионного транспорта, при котором
происходит перенос в клетку отдельных неорганических ионов.

5.

Анаболизм: совокупность реакций, обеспечивающих биосинтез сложных
соединений (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и др. полимеров) из
соответствующих низкомолекулярных соединений. Процесс, противоположный
катаболизму. Необходимая для А. энергия (главным образом в форме АТФ)
поставляется либо за счет реакций окисления органических или неорганических
соединений (дыхание, брожение), либо за счет конверсии света (фотосинтез).
Катаболизм (диссимиляция) – совокупность реакций метаболизма,
приводящих к расщеплению сложных органических веществ. Сопровождается
синтезом АТФ (по этой причине под К. понимают обычно энергетический обмен
клетки), низкомолекулярных соединений, которые используются клеткой в
биосинтезе (анаболизме).
Амфиболизм: все реакции промежуточного обмена клетки. К амфиболизму
относятся процесс образования в ходе катаболизма мономеров при
разрушении (деградации) сложных субстратов.

6. ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ – перенос электронов
ТРАНСФЕРАЗЫ – перенос различных химических групп
ГИДРОЛАЗЫ – перенос функциональных групп на молекулу
воды
ЛИАЗЫ – присоединение групп по двойным связям и
обратные реакции
ИЗОМЕРАЗЫ – перенос групп внутри молекулы с
образованием изомерных форм
ЛИГАЗЫ (синтетазы) – образование связей С-С, С-S, C-O, CN за счет реакций конденсации с распадом АТФ.

7.

Экзоферменты: ферменты, локализованные на внешней стороне клеточной
мембраны или между клеточной стенкой и клеточной мембраной; или
выделяющихся во внешнюю среду. Экзоферменты играют большую роль в
обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь
источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз являются
экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют
крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и
димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов,
например гиалуронидаза, коллагеназа, являются ферментами агрессии.
Эндоферменты прочно связаны с протоплазмой клетки и действуют только
внутриклеточно, осуществляя дальнейшее разложение поступающих
питательных веществ и превращение их в составные части клетки (например,
дегидрогеназы, оксидазы).
Пермеазы: белки–переносчики, участвующие в активном
транспорте веществ через цитоплазматическую мембрану. Обладают
специфичностью к переносимым соединениям. Перенос веществ П.
осуществляется против градиента их концентраций и зависит от АТФ или
др. носителей метаболической энергии. Кишечная палочка содержит 30—60
различных П.

8.

В зависимости от условий образования ферментов их разделяют на
конститутивные и индуцибельные.
Конститутивными называют ферменты, синтезируемые клеткой
вне зависимости от того, на какой среде бактерия выращивается.
Например, ферменты гликолиза (катализируют распад глюкозы).
Индуцибельные ферменты продуцируются бактерией лишь в ответ
на действие специфического индуктора, присутствующего в среде.
Индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует
индуктор. При этом ферменты синтезируются заново во всех клетках
одновременно. Индукторами биосинтеза являются многие питательные
вещества. К индуцибельным относится большинство гидролитических
ферментов, например, 5-галактозидаза - катализирует гидролитическое
расщепление лактозы на составляющие моносахариды.

9. «Пестрый ряд» (среды Гисса).

Состав: к 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор определенного углевода
(глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в 1
N растворе NaOH), разливают по пробиркам. В пробирки помещают поплавок
(трубка длиной около 3 см, один конец которой запаян) для улавливания
газообразных продуктов, образующихся при разложении углеводов. Среда при рН
7,2—7,4 бесцветна. При разложении углеводов она приобретает красный цвет.
Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред
"пестрого ряда". Короткий "пестрый ряд" включает жидкие среды Гисса с моно- и
дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом —
маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят
среды с разнообразными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза
и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.).
Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в среды
"пестрого ряда". Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—24 ч или больше. В
том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых
продуктов, наблюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до
кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек
газа в поплавке. Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа
регистрируется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не
меняется.
Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого
вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая
картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют
"пестрым рядом".

10. Биохимическая активность Escherichia coli на укороченном «пестром ряду» - ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу

Биохимическая активность Escherichia coli на укороченном «пестром ряду» ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу (1), маннит (2) и лактозу (3), а
также не разлагает мочевину.
Ферментация углеводов с образованием кислоты приводит к покраснению среды (в
среду добавлен индикатор нейтральный красный); газообразование проявляется
появлением пузырей газа в поплавках. При гидролизе мочевины (6) происходит
защелачивание среды за счет образование аммиака и ее посинение (в пробирку
добавлен индикатор бромтимоловый синий).

11.

Ферментативные свойства эшерихий и
тифозно-паратифозных бактерий
Вид
Escherichia coli
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi A
Salmonella schottmuelleri
Лактоза Глюкоза Мальтоза
кг*
-
кг
к
кг
кг
кг
к
кг
кг
Манит
кг
к
кг
кг
Сахароза
кг
-
Индол H2S
+
-
+
+

12.

2. Система индикаторных бумаг (СИБы).
Принцип действия: диски фильтровальной бумаги, пропитанные питательными
средами (питательная основа + субстрат + индикатор) и высушенные, хранятся во
флаконах. В лаборатории диски раскладываются в стерильные пробирки и
заливаются густой суспензией исследуемой культуры в физрастворе. Учет
проводят после 18-24 часовой инкубации в термостате по изменению цвета
индикатора.
3. Панели биохимической идентификации.
Принцип действия: в лунках специальных пластиковых панелей находятся
высушенные питательные среды (питательная основа + субстрат + индикатор). В
лунки вносят суспензию испытуемой культуры и после инкубации (от 5 до 24
часов) учитывают результат по изменению цвета индикатора.
Примеры: Панель биохимической дифференцировки энтеробактерий - ПБДЭ
(Россия); АР1-20Е (Франция);Crystal (США).
4. Системы автоматизированной идентификации.
Принцип действия тот же, что и в предыдущем пункте, однако инкубация
панелей, учет результатов и идентификация проводятся при помощи компьютера.
Примеры: МЗ-2 (США); BIOSCREEN (Финляндия); SEPTOR (США)

13. Определение биохимических свойств микроорганизмов

Основные биохимические свойства микроорганизмов:
• Сахаролитические (определение на средах Гисса)
• Протеолитические (расщепление белка и образование
индола, сероводорода, мочевины и аммиака)
• Окислительно-восстановительные.
• Протеолитические ферменты микробов – протеазы,
катализирующие расщепление белка. Для их выявления
исследуемую культуру засевают в питательную среду,
содержащую тот или иной белок (желатин, свернутая
лошадиная сыворотка, коагулированный яичный белок,
молоко и т.д.). При наличии протеолитических свойств
питательная среда разжижается.

14.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной
протеолитической активностью обладают способностью расщеплять
белок и пептон до продуктов глубокого распада: индола,
сероводорода, мочевины и аммиака.
• Определение индола: индол образуется при расщеплении
триптофана. После посева в пробирку вносят полоску индикаторной
бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы
индикаторная бумага не касалась питательной среды (прижимают
пробкой); посев инкубируют 24-48 часов при температуре 37 град.
Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца
индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет.
• Определение сероводорода (конечный продукт расщепления
аминокислот, содержащих серу – цистина, цистеина и метионина).
Петлю исследуемой культуры засевают в пробирку с МПБ. Тотчас
после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца
полоску индикаторной бумаги. Образующийся в культуре
сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца
и превращается в сульфат свинца, который придает индикаторной
бумаге черно-бурое окрашивание.

15.

• Определение гидролиза мочевины: проводится на среде
Гисса с мочевиной и индикатором бромтимоловым синим.
При наличии гидролиза происходит защелачивание среды за
счет образование аммиака, индикатор приобретает синий
цвет.
• Образование аммиака. Для определения способности к
образованию аммиака проводят посев в МПБ, и между его
поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой
бумаги. При положительном результате бумажка синеет.
• Окислительно-восстановительные ферменты (связаны
главным образом с дыхательной функцией микроорганизма):
тесты на каталазу и цитохромоксидазу, редуцирующую
способность.

16. Тест на каталазу

Каталаза— фермент,
который катализирует
разложение
образующегося в
процессе
биологического
окисления токсичного
пероксида водорода на
воду и молекулярный
кислород.
• В пробирку вносят 4-5 капель 3% раствора перекиси водорода Деревянной
палочкой (зубочисткой) снимают с агара колонию и опускают в реактив.
При положительном результате появятся пузырьки газа.

17.

Тест на цитохромоксидазу (фермент класса оксидоредуктаз).
• Функция цитохромоксидазы — восстановление кислорода с помощью
электронов цитохрома-с и транспорт протонов сквозь клеточную
мембрану. Энергия, полученная в этом процессе, используется для
создания трансмембранного протонного градиента
• На чашку Петри с выросшей культурой наливают 1% раствор
тетраметил-парафенилендиамина гидрохлорида. Культура,
обладающая оксидазой, окрашивается в пурпурно-красный цвет.
Тест на редуцирующую способность бактерий (в метиленовом молоке)
основан на следующей особенности: при окислительновосстановительных реакциях у бактерий акцептором водорода может
быть кроме молекулярного кислорода ряд органических красителей,
которые, присоединяя водород, восстанавливаются и
обесцвечиваются (в анаэробных условиях). Такие свойства отмечены у
лакмусовой настойки, метиленового синего, малахитового зеленого и
т. д. Например, в готовом виде молоко с метиленовым синим
голубого цвета. Через сутки инкубирования посевов в случае
редукции красителя среда окрашивается в кремовый цвет.