Этапы выделения чистых культур. Идентификация микроорганизмов

1. Этапы выделения чистых культур. Идентификация микроорганизмов

СПбГУ 2015г.
к.б.н. Орлова О.Г.

2. РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ НА ЖИДКИХ И ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ. ФАЗЫ РАЗВИТИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОПУЛЯЦИИ

• Размножение бактерий определяется временем
генерации, т. е. периодом, в течение которого
осуществляется деление клетки.
• Продолжительность генерации зависит от вида
бактерий, возраста, популяции, состава
питательной среды, температуры и других
факторов.
• В оптимальных условиях время генерации у разных
бактерий колеблется довольно в широких пределах:
от 20 мин у кишечной палочки до 14 ч у
микобактерий туберкулеза, в связи с чем, их
колонии образуются через 18—20 ч, либо через 3—
5 нед. соответственно.
2

3. Кривая роста микроорганизмов

Время культивирования
3

4. Особенности микробного роста на жидких питательных средах

• 1. Рост бактерий с равномерным помутнением
среды.
• 2. Придонный рост бактерий, характеризующийся
образованием осадка на дне пробирки с жидкой
питательной средой.
• 3. Пристеночный рост бактерий, выражающийся в
образовании рыхлых хлопьев, прикрепленных к
внутренней поверхности стенок сосуда.
• 4. Поверхностный рост бактерий,
характеризующийся появлением на поверхности
жидкой питательной среды пленки.
4

5. Этапы выделения чистой культуры микроорганизмов

I этап (нативный материал)
• Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре).
• Посев на плотные питательные среды (получение колоний).
II этап (изолированные колонии)
• Изучение колоний (культуральные свойства бактерий).
• Микроскопическое изучение микроорганизмов в окрашенном мазке
(морфологические свойства бактерий).
• Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой
культуры.
III этап (чистая культура)
• Определение культуральных, морфологических, биохимических
и других свойств для идентификации культуры бактерий
5

6. Выделение чистой культуры

Культуральные свойства:
Характеристика колоний микроорганизма
6

7. Морфологическое и структурное разнообразие колоний

1 — формы выпуклости колоний над поверхностью питательной среды; 2 — очертания
колоний; 3 — характер края колоний; 4 — внутренняя структура колоний.
7

8. Форма колоний:

а – круглая; б – круглая с фестончатым краем;
в – круглая с валиком по краю; г; д – ризоидная; е – с ризоидным краем;
ж –амебовидная; з – нитевидная; и – складчатая; к – неправильная;
л – концентрическая; м – сложная
8

9. Профиль колоний

а – изогнутый;
б – кратерообразный;
в – бугристый;
г – врастающий в агар;
д – плоский;
е –выпуклый;
ж – каплевидный;
з - конусовидный
9

10. Край колоний

а - гладкий;
б – волнистый;
в – зубчатый;
г – лопастный;
д – неправильный;
е – реснитчатый;
ж – нитчатый;
з – ворсинчатый;
и - ветвистый
10

11. Пигменты бактерий

Колонии многих бактерий могут быть ярко окрашены, что связано с выделением
окрашивающего вещества в среду либо окраской самих бактерий. Среди пигментов
преобладают жёлтые, оранжевые и красные каротиноидные пигменты.
Пигменты бактерий — вторичные метаболиты, то есть они не являются веществами,
обязательно присутствующими у всех бактерий. Например, даже внутри одного вида Serratia
marcescens есть пигментообразующие и беспигментные штаммы.
Способность к пигментообразованию выражена у видов Sarcina, Micrococcus, Staphylococcus,
Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia и др. Этот признак генетически детерминирован,
поэтому его используют в качестве дифференцирующего критерия.
Пигменты: 1.участвуют в метаболизме бактерий, 2.повышают их устойчивость к химическим
веществам, 3. защищают бактерии от действия видимого света и УФ-лучей. Мутанты,
лишённые способности к пигментообразованию, быстро погибают на свету. Искусственно
окрашенные бактерии (например, метиленовым синим) также проявляют повышенную
лабильность к инсоляции. Бактерицидное действие солнечного света проявляется в
присутствии кислорода и обусловлено фотоокислением. При этом клеточные пигменты
(флавины и цитохромы) действуют как катализаторы.
Каротиноиды ингибируют этот процесс. У некоторых бактерий образование пигментов
происходит только на свету.
Многие пигменты проявляют антибиотические свойства. Между пигментацией и
образованием вторичных метаболитов существует такая тесная корреляция, что при наличии
пигментов можно с большой долей вероятности ожидать образования антибиотиков и других
БАВ.
11

12. Пигменты микроорганизмов

Пигмент
Цвет
Микроорганизм
Каротиноиды
Красный,
оранжевый,
желтый
Микобактерии,
сарцины,
актиномицеты
(защищает от
ультрафиолета)
Хиноновые
Желтые
Микобактерии
туберкулеза
Меланиновые
Черные,
коричневые
бактериоиды
Пирроловые
Ярко-красные
Serratia
marcescens,
актиномицеты
Фенозиновые
Сине-зеленые,
при этом может
меняться
Синегнойная
палочка
(пиоцианин)
12

13. Биохимические признаки (свойства) бактерий

• определяются набором ферментов,
присущих определенному роду, виду,
варианту микроорганизмов
• Выявляют посевами на дифференциальнодиагностические среды
13

14. Ферменты бактерий

Энзимы – специфические белки, которые катализируют химические реакции.
• Классификация ферментов бактерий:
1.
По типу катализируемой реакции – оксиредуктазы, лиазы, трасферазы,
гидролазы и т.д.
2.
По локализации – эндоферменты – катализируют реакции внутри клетки.
Экзоферменты – выделяются из бактериальной клетки, катализируют
расщепление
3.
Генетический контроль образования – конститутивные (в течение всего
жизненного цикла, не влияет наличие субстрата), индуцибильные – они
образуются в ответ на наличие субстрата
4.
По субстрату – протеолитические – расщепляют белки, сахаролитические –
расщепляют углеводы, липолитические – расщепляющие жиры.
14

15. Протеазы

• расщепляют белки до аминокислот, мочевины, индола,
сероводорода, аммиака. По выделению этих продуктов
на средах с белком выявляют наличие протеаз.
Среды:
• С желатином, разжижение среды
• На свернутой сыворотке по ее разжижению
• На молоке по его просветлению
• Казеин – будет разрушаться, белок свертываться.
• На МПБ по выделению газа индола и сероводорода,
которые выявляют с помощью индикаторных бумажек
15

16. Протеолитические свойства микроорганизмов

1 - формы разжижения желатина; II - определение сероводорода; III - определение
индола: 1 - отрицательный результат; 2 - положительный результат
16

17. Бумажные индикаторные системы

• представляют собой полоски или диски
хроматографической бумаги, пропитанные
соответствующими субстратами и
индикаторами и покрытые для
стабилизации пленкообразующим
полимером — водным раствором
поливинилового спирта.
17

18. Сахаролитические ферменты

• расщепляющие углеводы
• Эти ферменты расщепляют углеводы до альдегидов,
кислот, углекислого газа и H2.
• Для их определения используют МПБ или МПА, к
которым добавляют индикатор кислотообразования +
углевод + поплавок для газообразования.
• Пример - среды Гисса. Если свет среды меняется,
выделяется газ, значит идет расщепление углеводов
(моносахара).
• На этом принципе создаются панели, планшеты,
бумажные индикаторные системы и приборы для учета
ферментативной активности.
18

19. Среды Гисса

19

20. Липолитические ферменты

– липазы – выявляют на ЖСА – желточносолевой агар, который содержит желток,
разрушение липидов желтка
сопровождается помутнением среды
20

21. Комплексная система идентификации бактерий

Микробиологический анализатор Multiskan FC
Позволяет идентифицировать более 500 видов
микроорганизмов и патогенных грибов.
Система микробиологической диагностики включает
оценку данных, полученных в результате
проведения исследований по идентификации
микроорганизмов и определении их
антибиотикочувствительности in vitro, и коррекцию
их на основании сведений о природной
устойчивости или чувствительности отдельных
микроорганизмов или их групп, о распространении
среди них приобретенной резистентности, а также
сведений о корреляции данных по
чувствительности, полученных in vivo, клинической
эффективности антибактериальных препаратов.
21

22.

22

23. Бактериофаги

Вирулентные фагиПрогрессивная инфекция
Умеренные фагиЛизогенная инфекция
• Лизогения - ДНК фага включается в кольцевую хромосому
бактериальной клетки. Во время деления клетки профаг
(интегрированная ДНК фага) реплицируется в составе
клеточного генома и переходит в следующие поколения
бактерий. Бактериальная культура, инфицированная
умеренным фагом, сохраняет жизнеспособность и становится
лизогенной
• Лизогенная (фаговая) конверсия - процесс изменения свойств
бактерии, под действием дополнительного набора генов,
внесенных профагом в клетку, с приобретением ею
токсигенных свойств (например, появление способности к
образованию экзотоксина у возбудителей ботулизма, дифтерии
и т.д.).

24. ФАГОИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ ПО МЕТОДУ ОТТО (МЕТОД СТЕКАЮЩЕЙ КАПЛИ)

На чашку с МПА шпателем выполняется
посев суточной бульонной выделенной
культуры бактерий. Затем наносят каплю
известного бактериофага и, наклонив
чашку, дают капле несколько растечься по
поверхности питательной среды. Через
сутки наблюдают полную задержку роста
в месте внесения диагностического фага.

25. ФАГОИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ ПО МЕТОДУ ФЮРТА

• В расплавленный и остуженный
МПА (45-500С) добавляют
определенный бактериофаг и
выливают в чашку Петри. Чашка с
полученным агаром делится на
несколько секторов, в каждый из
которых засеваются неизвестные
культуры, выделенные от
больных. Там, где культура
соответствует бактериофагу,
наблюдается отсутствие роста
(лизис) бактерий.

26. ФАГОТИПИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ ПО МЕТОДУ ФИШЕРА

• Испытуемую суточную
бульонную культуру засевают
на МПА, затем условно делят
чашку на квадраты. В каждый
квадрат наносят по одной капле
различных фагов. После
суточной инкубации в
термостате отмечают квадраты,
в которых отмечается лизис
бактерий. Фаготип
бактериальной культуры
определяется типом
лизирующего ее фага.

27. Титрование в жидкой среде по Аппельману

Литическое действие бактериофагов (справа – положительный результат)

28. ТИТРОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГА ПО МЕТОДУ ГРАЦИА

Ряд последовательных разведений фага
по 1,0 мл смешивают в пробирке с
0,5 мл бактериальной культуры и
добавляют в эту же пробирку
расплавленный МПА. Все
содержимое выливают в чашку с
МПА. Дают застыть верхнему
тонкому слою и ставят в термостат.
При встрече фага с бактерией,
происходит лизис последней и
образуется негативная колония фага.
Такие негативные колонии затем
подсчитывают для определения
титра. Титром фага называют
количество фаговых частиц в 1 мл
препарата фага.

29. Применение бактериофагов в диагностике и медицине

Фаги выпускают в жидком виде (ампулы и флаконы), лиофильно
высушенными, в таблетках и свечах. Таблетки фагов, предназначенные для
применения через рот, покрыты кислотоустойчивой оболочкой, защищающей
фаги от действия соляной кислоты желудочного сока.
Препараты бактериофага составлены из вирулентных бактериофагов
широкого спектра действия, активных против антибиотикорезистентных
бактерий. Перед применением необходимо определить
фагочувствительность возбудителя инфекции.
Все препараты фагов подлежат обязательному контролю на отсутствие
посторонней флоры, безвредность и активность (титр), который
осуществляется на выпускающем их производстве. Выборочный контроль
производят в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских
биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Выпускаемый фаг снабжен
этикеткой, на которой указано: учреждение, его выпускающее, название фага,
серия, номер контроля и срок годности. Каждая упаковка снабжена
наставлением по применению и хранению фага.

30.

Бактериофаг дизентерийный поливалентный
Иммунопрепарат (г.Уфа) (Россия)
Бактериофаг клебсиелл пневмонии
Микроген НПО ФГУП (Биомед НПО (г.Пермь)) (Россия)
Бактериофаг коли жидкий
Биомед (г.Пермь) (Россия)
Бактериофаг колипротейный жидкий
ИмБио-Нижегородское ГП по произ.бакпреп (Россия)
Бактериофаг сальмонеллезный
ИмБио-Нижегородское ГП по произ.бакпреп (Россия)
Бактериофаг синегнойный жидкий
Биомед (г.Пермь) (Россия)
Бактериофаг стафилококковый жидкий
Микроген НПО (Россия)
Бактериофаг стрептококковый жидкий
Микроген НПО ФГУП (Биомед НПО (г.Пермь)) (Россия)

31. Спасибо за внимание!