Особенности метаболизма микроорганизмов, используемые при биодеградации

1. Особенности метаболизма микроорганизмов, используемые при биодеградации

Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное бюджетное государственное образовательное учреждение
высшего образования «Оренбургский государственный университет»
Химико-биологический факультет
Кафедра биохимии и микробиологии
Особенности метаболизма
микроорганизмов, используемые
при биодеградации
Лекция 15
Лектор: Давыдова Ольга Константиновна, к.б.н., доцент

2. План лекции:

Биодеградация: стадия и пути преобразования
Ксенобиотики и свойства, определяющие их
токсичность
Конструирование микроорганизмов и решение
проблем экологии

3. Введение

© http://rugreenzoner.blogspot.ru/2013/08/blog-post_21.html

4. Введение

С развитием химической
промышленности в биосферу
стало поступать более тысячи
различных ксенобиотиков,
которые в значительной степени
устойчивы и тем самым
загрязняют окружающую среду
Таким образом, деградация
ксенобиотиков микроорганизмами
является одной из важных проблем
защиты биосферы
Преимущество бактериальной
очистки по сравнению с химической
в том, что она не вызывает
появления нового загрязняющего
агента в окружающей среде.
Доказано, что при повторном
попадании в среду многих
химических соединений
адаптационный период
микроорганизмов к данному
субстрату значительно короче,
по сравнению с первым
попаданием этого соединения.
Повышение деградирующей
способности возможно также в
результате стимуляции
естественной микрофлоры, уже
адаптированной к токсикантам

5. Биодеградация

6. Биодеградация

Поведение ксенобиотика в природе зависит от многих
взаимосвязанных факторов: структуры и свойств самого
соединения, физико-химических условий среды и ее
биокаталитического потенциала, определяемого
микробным пейзажем.
Поиск микроорганизмов-деструкторов:
1) выделение микробных изолятов из длительное время
загрязняемых сред
2) проверка генетического закрепления деградирующей
способности
3) оценка степени и сроков деструкции загрязнителя
4) проверка штаммов микроорганизмов-деструкторов на
безопасность для теплокровных животных
5) депонирование штаммов в Международной коллекции
промышленных микроорганизмов и патентование

7. Основные процессы биодеградации

окислительно-восстановительные реакции;
реакции декарбоксилирования;
реакции дезаминирования;
реакции с углеводными субстратами (гликозилирование,
трансгликозилирование);
алкилирование (метилирование);
реакции переноса ацильных групп (включая гидролиз, при
котором ацильные остатки переносятся на воду);
реакции галогенирования;
реакции переноса нуклеотидных остатков;
реакции изомеризации.

8. Пути биодеградации

© http://www.bestreferat.ru/referat-293398.html

9. Стадии биодеградации

Трансформация молекулы
Фрагментация (разложение) молекулы на простые соединения
Минерализация или превращение сложного вещества в простое
Кометаболизм – процесс деструкции микроорганизмами, который
протекает сопряженно с использованием ими другого
соединения, являющегося источником энергии

10. Ксенобиотики

Ксенобиотики (от греч. ξενος — чужой + βιος — жизнь) — чужеродные
для организма химические вещества. Ксенобиотики не являются
естественными метаболитами живых организмов, не обязательно
ядовиты. Однако в большинстве случаев могут вызывать различные
токсические или аллергические реакции, изменения
наследственности, снижение иммунитета
Примеры ксенобиотиков:
свободные металлы (кадмий, свинец, ртуть )
фреоны
нефтепродукты
Пластмассы (полиэтилен, пластик)
полициклические и галогенированные ароматические
углеводороды
Многие вещества, например ксилол, стирол, толуол, ацетон, бензол,
пары бензина или нефть - могут быть отнесены к ксенобиотикам, если
будут обнаружены в окружающей среде в неестественно высоких
концентрациях, связанных с промышленным производством.

11. Биодеградация ксенобиотиков

Биодеградация ПАВ начинается с сульфонатной группы (если R от 1 до
3) или с боковой цепи (при R>3)
Сложных ароматических и гетероциклических соединений
(красителей, фармпрепаратов) с разрыва индольного кольца
Гетероциклические соединения сначала окисляются, а потом
происходит разрыв кольца (легче разрушаются азот- и
кислородсодержащие гетероциклические соединения, чем
серосодержащие вещества)
Полимерные соединения за счет разрастания грибов на микротрещинах
и последующего воздействия их фрментов и кислот (повышенной
устойчивостью обладают полиэтилен, полипропилен, полистирол,
жесткий поливинилхлорид, полиамид, полимерные смолы)
© http://www.goinggreensolutions.com.au/wp/wp-content/uploads/2013/08/biodegradable1.jpg

12. Классификация ксенобиотиков по способности к биодеградации

1. Биодеградабельные токсиканты, относительно легко
разрушающиеся в окружающей среде под влиянием как
абиотических, так и биотических факторов. К ним относятся вещества биологического происхождения и некоторые органические
соединения небиологического генезиса (n-алканы нефти, спирты,
альдегиды и т. д.)
2. Персистентные ксенобиотики - очень устойчивые соединения,
разлагающиеся крайне медленно. Среди этой группы соединений
наибольшую известность получили хлорорганические пестициды,
в частности ДДТ
3. Рекальцитранные ксенобиотики - соединения, которые
практически не разлагаются, либо вообще в принципе не могут
разлагаться. К ним, в первую очередь, относятся тяжелые металлы
и радионуклиды с большим периодом полураспада

13. Удаление ксенобиотиков

Для биодеградации ксенобиотиков лучше использовать ассоциации
микроорганизмов, так как они более эффективны, чем отдельно взятые
виды.
Наиболее активно разрушают ксенобиотики бактерии и грибы,
выделенные из почвы и воды. Самыми способными к борьбе с
загрязнителями различного типа являются представители рода
Pseudomonas – они практически «всеядны». Клетки этих
микроорганизмов содержат оксидоредуктазы и гидроксилазы, способные
разлагать большое число молекул углеводородов и ароматических
соединений.
Участвуют в разрушении ксенобиотиков
Бактерии : Pseudomonas, Sphingomonas, Burkholderia, Alkaligenes,
Acinetobakter, метанобразующие и нитрифицирующие бактерии, а из
грамположительных — представителей родов Arthrobakter, Nokardia,
Rhodococcus, Bacilus. Некоторые виды нитрат- и
сульфатредуцирующих бактерий, а также метаногенные археи
Грибы: Phanerochaete (возбудители «белой гнили»),Penicillum,
Trichoderma, Fusarium

14. Удаление ксенобиотиков

Способность микроорганизмов селективно связывать определенные
ионы, может быть использована для концентрирования металлов в
виде биомассы этих микроорганизмов.
Известно, например, что ионы калия могут накапливаться в
бактериальной клетке в концентрациях до 0,2М при содержании их в
среде 0,00001М.
Многие микроорганизмы способны метилировать ртуть, превращая ее в
летучие производные (диметилртуть), очищая при этом от ртути
окружающую среду. В летучие формы переходят также мышьяк, селен,
теллур.

15. Биотрансформация стероидов

Одним из примеров микробной трансформации является
трансформация стероидных соединений.
Стероиды представляют собой производные
циклопентанпергидрофенантрена и широко распространены в
природе.
На их основе производится большое количество разнообразных
лекарственных препаратов.
18
12
11
19
2
3
4
14
17
D
16
15
9
1
A
C
13
10
5
B
8
7
6
циклопентанпергидрофенантрен

16. Биотрансформация стероидов

Схема превращений стероидов грибом Botrytis cinerea
17-оксипрогестерон (1) удается превратить исключительно в 6окси производное 17-оксипрогестерона (2)

17. Биотрансформация стероидов

В синтезе гидрокортизона, кортизона и преднизолона ключевым
соединением является так называемое «вещество S Рейхштейна»,
которое является, в свою очередь, продуктом модификации
моноацетата «вещества R» с помощью культуры Corynebacterium
mediolanum

18. Биотрансформация стероидов

Реакция
Субстрат
Продукт
Микроорганизм
11α-гидроксилирование
Прогестерон
11α-гидроксипрогестерон
Rhizopus
nigricans
11β-гидроксилирование
Вещество S
Гидрокортизон
Curvularia
lunata
16α-гидроксилирование
9α-фторкортизол
9α-фтор-16αгидроксикортизон
Streptomyces
roseochromogenus
1,2-дегидрирование
Гидрокортизон
Преднизолон
Arthrobacter
simplex
Расщепление
боковой цепи
β-ситостерин
Андростадиендион Mycobacteи (или) андростен- rium spp.
дион

19. Биотрансформация углеводов

Acetobacter suboxidans окисляет D-сорбит в L-сорбозу весьма
специфично, без каких-либо побочных продуктов. Сорбоза далее
используется в химическом синтезе аскорбиновой кислоты
CH2OH
CH2OH
H
HO
H
OH
H
H
OH
H
OH
CH2OH
D-сорбит
Acetobacter
suboxidans
HO
H
OH
H
OH
O
CH2OH
L-сорбоза

20. Биотрансформация углеводородов

Алифатические соединения
трансформируются путем
гидроксилирование
H3C(CH2CH2)nCH2CH2OH
H3C(CH2CH2)nCH2CH3
окисления концевых групп
дегидрогеназами с последующим
окисление спирта до
альдегида
присоединением воды по
O
образовавшейся двойной связи,
H3C(CH2CH2)nCH2C
окислением спиртовой группы до
H
окисление
альдегида до кислоты и
карбонильной и отщеплением
образование тиоэфира
двухуглеродного фрагмента в
O
H3C(CH2CH2)nCH2C
виде ацетил-СоА. Такой процесс
S-CoA
продолжается до полного
окисление и отщепление
расщепления углеводородного
двухуглеродного фрагмента
радикала.
O
O
При наличии разветвлений в
углеводородной цепи механизм
несколько меняется, но
принципиально остается тем же.
H3C(CH2CH2)n-2CH2C
+
S-CoA
CH3C
S-CoA
Путь деградации н-парафинов

21. Биотрансформация ПАВ

Схема деградации сурфактантов на основе линейных
алкилбензолсуль-фонатов (LAS) и сульфонатов
моноалкилдифениловых эфиров (LADPEDS) α-протеобактерией
LAS – компоненты бытовых моющих средств.
LADPEDS – промышленные ПАВ

22. Биодеградация полициклических ароматических углеводородов

Такие соединения чаще всего встречаются в местах разлива нефти.
Первой стадией деградации ароматических соединений является их
окисление – введение в ароматическую сруктуры одной или двух
гидроксильных групп.
Эти реакции катализируют ферменты, относящиеся к группе оксигеназ:
моно- или диоксигеназы соответственно.
Структуры полициклических ароматических углеводородов, наиболее
трудно разрушаемых микроорганизмами:

23. Биодеградация полициклических ароматических углеводородов

COOH
COOH
п-оксибензойная кислота OH
бензойная кислота
COOH
COOH
COOH
O
COOH
OH
OH
O
O
карбоксимуконолактон
O
(+) - муконолактон
-CO2
O
OH
протокатеховая кислота
+O2
O
OH
пирокатехин
COOH
COOH
COOH
цис,цис- карбоксимуконовая кислота
цис,цис-муконовая
кислота
O
COOH
O
HOOC
COOH
COOH
лактон енола кетоадипиновой кислоты
+O2
COOH
COOH
CH2
CH2
C
кетоадипиновая
кислота
O
CH2
C
S
H2O
CoA
Ацетил-СоА + янтарная кислота
кетоадипинил-СоА

24. Биодеградация пирена

25. Биодеградация бензапирена

Видно, что во всех
вариантах процесс
начинается с
окислительной
деструкции одного из
циклов.
Окисленные продукты
(кислоты) ослабляют
ароматичность системы,
так что далее она
подвергается
дальнейшему
окислению, и в итоге
происходит постепенная
минерализация
субстрата.

26. Деградация галогенорганических соединений

Такие соединения наиболее часто встречаются среди пестицидов и
являются наиболее токсичными:
Cl
Cl
Cl
Cl
O
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Альдрин
Cl
Дильдрин
Во всех случаях их деструкции происходит замена атома галогена
на гидроксил.

27. Примеры инсектицидов и сроки их биоразложения

Название
Химическое строение
Период
сохранения
Эльдрин
1,2,3,4,10,10-гексахлор-1,4,4а,5,8,8агексагидроэндо-1,4-экзо-5,8диметанонафталин
> 9 лет
Хлорден
1,2,4,5,6,7,8,8а-октахлор2,3,3а,4,7,7а-гексагидро,4,7метаноинден
> 12 лет
ДДТ
2,2-бис(п-хлорфенил)-1,1,1трихлорэтан
10 лет
ГХЦГ
гексахлорциклогексан
> 11 лет

28. Деградация галогенорганических соединений

Дегалогенирование хлорароматических соединений на примере
дихлорбензойной кислоты
O
O
OH
C
C
Cl
O
C
O
S-CoA
NADPH
ATP
AMP+PPi
HCl
NADP++Cl-
Cl
OH
Cl
2
1
3
4
O
COOH
C
OH
O2
O
C
OH
H2O
OH
CoA-SH
NADH + O2
COOH
COOH
6
S-CoA
C
H2O
Cl
CoA-SH
Cl
S-CoA
NAD++ H2O
5
OH
Первая стадия процесса – подготовка исходного соединения к дегалогенированию – образование тиоэфира дихлорбензойной кислоты с СоА
Вторая стадия процесса – восстановительное дегалогенирование тиоэфира с
NADPH в качестве восстановителя. Удаление второго хлора протекает по
гидролитическому пути

29. Биодеградация инсектицида карбарила

Бактерия из рода Arthrobacter,
способная расти на карбариле,
как единственном источнике
углерода.
Часть генов, кодирующих
ферменты деградации
карбарила, содержится в
плазмидах.
Удаление плазмиды pRC1
приводит к утрате способности
расщеплять карбарил до 1нафтола; плазмида pRC2
контролирует окисление
нафтола до гентизиновой
кислоты.
Дальнейшая деградация
происходит с участием
хромосомных генов.

30. Биодеградация нитросоединений

Многие микроорганизмы способны утилизировать взрывчатые
вещества на основе тринитротолуола как аэробно, так и анаэробно с
образованием разнообразных продуктов, включая амино-,
гидроксиламинопроизводные, бензол, толуол и пр.
COOH
NO2
NO2
O2N
CH3
NO2
O 2N
NH2
NO2
CH3
OH
HO
OH
COOH
OH
CH3
O2N
NO2
NHCOCH3
OH

31. Конструирование микроорганизмов

Генетическая инженерия нашла также применение в разработке
способов определения и устранения загрязнений окружающей
среды.
В частности, сконструированы штаммы бактерий, которые
являются своеобразными индикаторами мутагенной активности
химических загрязнителей.
С другой стороны, генно-инженерным способом сконструированы
штаммы бактерий, которые содержат плазмиды, под контролем
которых происходит синтез ферментов, способных разрушать
многие химические соединения-загрязнители среды обитания. В
частности, некоторые плазмидосодержащие бактерии способны
разлагать до безвредных соединений нефть и нефтепродукты,
оказавшиеся в среде в результате различных аварий или других
неблагоприятных причин.

32. Генная инженерия для экологии

Бактерии родов Rhodococcus и Nocardia с успехом применяют
для эмульгирования и сорбции углеводородов нефти из водной
среды
Для извлечения металлов из сточных вод
широко
использоваться штаммы Citrobacter,
Zoogloea, способные
накапливать уран, медь, кобальт
Штаммы Pseudomonas putida несут катаболические плазмиды:
OCT расщепление октана, гексана, декана
XYL – ксилола и толуола;
CAM – камфары
NAH – нафталина.
CAM и NAH сами способствуют своему переносу
Получен «суперштамм», несущий плазмиды XYL и NAH и
гибридную плазмиду, содержащую части плазмид OCT и CAM

33. Генная инженерия для экологии

Штамм 1
Штамм 2
САМ
Хромосома
Плазмида
Штамм 3
ОСТ
Штамм 3
XYL
Скрещивание
и рекомбинация
плазмид
NAH
Скрещивание
XYL
САМ/OCT
NAH
Скрещивание
Супербацилла
САМ/OCT
XYL
NAH
© http://www.bestreferat.ru/referat-293398.html

34. Генная инженерия для экологии

Основные направления конструирования эффективных штаммов
для решения задач биодеградации поллютатнов и
биоремедиации загрязненных территорий:
исследование субстратной специфичности штаммов
микроорганизмов, выделенных из природных источников;
расшифровка биохимических путей деградации поллютантов;
усиление метаболического потенциала путем:
сосредоточения в одном штамме-хозяине генов,
кодирующих разные ферменты биодеградации с целью
придания новому штамму способности более полно
разрушать ксенобиотики в окружающей среде;
сосредоточения в одном штамме ферментов систем
деградации и продукции биосурфактантов, способствующих
переходу малорастворимых органических поллютантов
(полициклических ароматических соединений) в раствор;
повышения способности микробных клеток к захвату и
транспорту поллютантов во внутреннее пространство
клетки;

35. Генная инженерия для экологии

Модификация свойств микроорганизмов–биодеградаторов:
повышение устойчивости клеток к органическим растворителям
за счет введения в клетки генов цис-транс изомеризации
непредельных жирных кислот (повышение жесткости
мембраны);
введение генов транспортных белков для усиления активного
транспорта гидрофобных поллютантов в клетку;
исследование и использование системы хемотаксиса
микробных клеток к субстрату (движение клеток против
градиента концентрации субстрата);
повышение устойчивости штаммов-биодеградаторов к радиации
(Deinococcus radiodurans – как основа для конструирования
устойчивых к радиации биодеградаторов);
использование психрофильных микроорганизмов в качестве
биодеградаторов;
применение методов молекулярной эволюции для
оптимизации свойств штаммов-биодеградаторов.

36. Заключение

Таким образом, метаболический потенциал микроорганизмов
позволяет удалять из окружающей среды поллютанты самой
различной природы.
Остается невыясненным, как возникают ферментные системы,
способные разрушать столь чужеродные соединения.
Создается впечатление, что микроорганизмы могут сами
выступать в качестве «дизайнеров биокатализаторов».
В то же время, успехи генной и белковой инженерии позволяют
помочь микроорганизмам быстрее осуществлять этот дизайн, так
что речь идет о конструировании микроорганизмов для решения
задач биоремедиации.