Ризосферные плазмидосодержащие бактерии рода Pseudomonas для био/фиторемедиации загрязненных почв

1.

Ризосферные
плазмидосодержащие
бактерии рода Pseudomonas
для био/фиторемедиации
загрязненных почв
Кочетков В.В., Анохина Т.О., Сиунова Т.В., Сизова
О.И., Боронин А.М.
ФГБУН Институт биохимии и
физиологии микроорганизмов им. Г.К.

2.

Новая концепция фиторемедиации почв, загрязненных
смесью ПАУ с токсичными металлами и/или металлоидами
Конструирование
мультифункциональных
штаммов PGPR Pseudomonas
Стимуляция роста растений
и защита от фитопатогенов
Деградация ПАУ
Устойчивость к тяжелым
металлам/металлоидам
Инокуляция семян
мультифункциональными
штаммами и выращивание
растений на загрязненных
почвах

3.

Растение
Ризосферные
бактерии рода
Pseudomonas
ФИТОРЕМЕДИАЦИЯ
БИОРЕМЕДИАЦИЯ
АККУМУЛЯЦИЯ
ПОЛЛЮТАНТОВ
ДЕГРАДАЦИЯ
ТОКСИЧНЫХ
ОРГАНИЧЕСКИ
Х
СОЕДИНЕНИЙ

4.

Растительно-микробные взаимодействия в
ризосфере
Фитогормоны
PGPR
Plant Growth-Promoting
Rhizobacteria
Корневые экссудаты
Индукция системного
ответа растений
токсины
Фитопатогены
Антибиотики,
сидерофоры,
HCN

5.

Возможные превращения
поллютантов в процессе
фиторемедиации
By E. PilonSmits,
2004

6.

7.

Антимикробные метаболиты бактерий рода Pseudomonas
3

8.

Плазмиды, контролирующие биодеградацию
нафталина
Плазмида
Свойства
INC группа
Частота переноса в P.putida
NPL-1
pBS2
pBS101
pBS240
Nah+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
IncP-9
IncP-7/9
IncP-7
IncP-9
10-3
10-4
10-3
10-4
Размер (тпн)
100
130
50
160
pBS216
pOV17
pBS243
pBS213
pBS218
pBS219
pBS215
pBS242
pBS1191
pBS1141
pBS1181
pHK43
pHK72
p8C
p15C
p24C
p25C
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+
Nah+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
Nah+Sal+
IncP-9
IncP-9
IncP-7/9
IncP-7
IncP-7(2)
IncP-7(2)
IncP-? Not P-2, 7, 9
IncP-? Not P-2, 7, 9
IncP-9
IncP-9
IncP-9
IncP-7
IncP-9
IncP-9
IncP-9
IncP-9
IncP-9
10-3
10-4
10-4
10-4
10-4
10-4
10-5
10-5
10-7
10-4
10-6
ND*
ND
ND
ND
ND
ND
85
85
160
150
160
180
150
150
100
100
110
100
85
120
120
120
120
ND – not determined.

9.

Плазмиды биодеградации
увеличивают количество оксипроизводных феназина у PGPR
Pseudomonas
1 – P. fluorescenc 2-79, 2 - P. fluorescenc 279(pBS216)
3 – P. chlororaphis PCL1391, 4 - P. chlororaphis
PCL1391(pBS216)
5 – P. aureofaciens 1217, P. aureofaciens
1217(pBS216)
1 - P. aureofaciens BS1393, 2 - P.
aureofaciens BS1393(NAH7), 3 - P.
aureofaciens BS1393(pBS216), 4 - P.
aureofaciens BS1393(pBS3), 5 - P.
aureofaciens BS1393(SAL)
1 – plasmid less variant
of the P. aureofaciens
strain OV17,
2 - P. aureofaciens
OV17(pOV17),
3 - P. aureofaciens
OV17(pBS216)

10.

11.

Microclonal tobacco plants colonized by various
Pseudomonas bacteria on the Murashige & Skoog
with naphthalene (1mg/ml)
1
1.
2.
3.
4.
5.
2
3
- not colonized plant (control);
- P. aureofaciens B-2188 Д;
- P. aureofaciens B-2188 Д (pBS216);
- P. aureofaciens B-2188 Д (pNF142::TnMod-ОTc);
- P. aureofaciens B-2188 Д (pOV17)
4
5

12.

Колонизация корней растений табака
штаммом P. aureofaciens BS1393::gfp.
1 – отдельные клетки под люминесцентным микроскопом;
2 - корневые волоски растений табака, через месяц после
колонизации.

13.

Природные ризосферные штаммы
бактерий, способные одновременно
деградировать ПАУ и защищать растения от
фитопатогенов
M
M
M
phzD
nahAc
BS1393(p216)
IC71
IG1
OV17
IID5
VB1
IC7
BS1393(p216)
IC71
IG1
OV17
IID5
VB1
IC7
ПЦР анализ демонстрирует наличие штаммов, содержащих как гены
биосинтеза феназиновых антибиотиков, так и гены биодеградации ПАУ

14.

Штаммы и плазмиды, использованные
при конструировании
Штаммы/Плазмиды
Основные характеристики
Источник
мультифункциональных
PGPR
P.aureofaciens BS1393
Phz+, PCA, 2-OH-PCA, 2-OH-PHZ
ИБФМ
P.aureofaciens OV17(pOV17)
Phz+, PCA, 2-OH-PCA, 2-OH-PHZ
ИБФМ
P. fluorescens 38a
2, 4-DAPG
ИБФМ
P.chlororaphis PCL1391
PCN
Проф.
B.J.J.
Lugtenberg,
Голландия
pBS216
(83kb) Phe+ Nah+ Sal+
Inc P9 Tra+
ИБФМ
pOV17
(85kb) Phe+ Nah+ Sal+ Tra+
ИБФМ
pBS501
(65kb) Co/Ni resistance cnr- like
operon Tra+
ИБФМ
pUCP22::arsRBC or pKS1
Asr operon arsRBC from
P. aeruginosa PAO1
strain.
- strain produces phenazine-type
antibiotics;
ИБФМ
Phz+
PCA–phenazine-1–carboxylic
acid;
2-OH-PCA–
2-hydroxyphenazine-1-carboxylic acid;
2-OH-PHZ
–
2-hydroxy-phenazine;
PCN
–
phenazine-1carboxamide;
2,4-DAPG - 2, 4-diacetylphloroglucinol;
+
+
+

15.

Взаимодействие ризосферных
бактерий рода Pseudomonas с
растениями индийской горчицы
(Brassica juncea L.) в
гнотобиотической системе с
нафталином
•Стерильные проростки горчицы инокулировали перед посадкой
штаммами P. putida 53a(pOV17), 53a(pBS216) и P. aureofaciens
OV17(pOV17). Неинокулированные проростки служили контролем.
•Растения культивировали в гнотобиотических условиях:
стерильный песок + среда Murashiga&Skoog с добавлением
нафталина (200 мкг/г), влажность около 10%.
•Штамм P. putida 53a(pBS216) продуцировал неидентифицированные
интермедиаты окисления нафталина, которые ингибировали рост

16.

Конструирование штамма PGPR P. chlororaphis
PCL1391(pBS216,pBS501), способного к деградации
ПАУ и устойчивого к тяжелым металлам

17.

Ингибирование фитопатогенных грибов
ризосферными бактериями
в присутствии тяжелых металлов
Co2+ 0,5 mM
C o nc e ntr a tio n o f m e ta ls, m M
BS1393
(pBS501)
Ni2+ 0,5 mM
BS1393
Control
BS1393
(pBS501)
BS1393
BS1393
BS1393
(pBS501)
Pseudomonas
aureofaciens
BS 1393(pBS501)
8
7
6
5
4
Bipolaris
sorokiniana
Fusarium
solani
3
2
1
Fusarium
graminearum
Gaeumannomyces
graminis
var. tritici
Rhizoctonia sp.
Verticillium
albo-atrum
Fusarium
heterosporum
0
Co2+
Ni2+
Pseudomonas
aureofaciens
BS 1393

18.

Рост различных плазмидосодержащих вариантов
штамма P. chlororaphis PCL1391 на жидкой синтетической
среде с нафталином и на среде с нафталином и
никелем (100мкМ)
А) OD
Б) CFU
0,8
1E+11
0,7
1E+09
0,6
1E+08
КОЕ/мл
ОП540
1E+10
0,5
1E+07
100000
0
100000
0,4
0,3
10000
0,2
1000
100
0,1
10
0
0
6
12
18
24
30
36 42
часы
48
54
60
PCL1391(pBS216) нафталин
PCL1391(pBS216) нафталин+Ni 100 мкМ
PCL1391(pBS216,pBS501) нафталин
PCL1391(pBS216,pBS501) нафталин+Ni 100 мкМ
66
72
78
1
0,03
0,2
0,4
0,6
PCL1391(pBS216) нафталин
PCL1391(pBS216) нафталин+Ni
PCL1391(pBS216,pBS501) нафталин
PCL1391(pBS216,pBS501) нафталин+Ni

19.

Влияние чувствительных и устойчивых к никелю
ризосферных штаммов-деструкторов ПАУ на рост сорго
в почве, загрязненной ПАУ и никелем
1
2
3
4
5
6
1 – no bacteria, PAHs+Ni; 2 – no bacteria, clean soil;
3 – PCL1391(pBS216), clean soil; 4 - PCL1391(pBS216,pBS501), clean soil;
5 - PCL1391(pBS216), PAHs+Ni; 6 - PCL1391(pBS216,pBS501), PAHs+Ni

20.

Деградация нафталина мультифункциональным
штаммом
P. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) в
присутствии никеля (100 mkM)

21.

Конструирование рекомбинантных штаммов PGPR
Pseudomonas – деструкторов ПАУ и устойчивых к
соединениям мышьяка
P G P R P se u d o m o n a s
Nah+
T h e p la s m id
o f a r s e n i c r e s i s t a n c e , A s R
T r a n s fo r m a t io n
P G P R P se u d o m o n a s
Nah+ , A sR
Реципиенты – полученные ранее
штаммы P. aureofaciens BS1393 и
P. chlororaphis PCL1391 с
плазмидой биодеградации
нафталина pBS216
Для трансформации реципиентов
использовали рекомбинантную
плазмиду pUCP22::arsRBC.
Плазмида содержит оперон
резистентности к мышьяку
arsRBC, клонированный из P.
aeruginosa PAO1
В результате трансформации
получены рекомбинантные
штаммы P. aureofaciens BS1393 и
P. chlororaphis PCL1391 с двумя
плазмидами pBS216 и
pUCP22::arsRBC

22.

Использование PGPR
Pseudomonas в
фиторемедиации почв,
загрязненных мышьяком

23.

Влияние различных штаммов PGPR Pseudomonas,
устойчивых и чувствительных к мышьяку, на рост сорго в
условиях загрязнения почв ПАУ и мышьяком
PA H s + A s
+ P C L 1 3 9 1 (p B S 2 1 6 )
C o n tro l
C o n tro l
(PA H s+ A s)
PA H s+ A s+
P C L 1 3 9 1 ( 2 p la s m in s )
PA H s + A s
B S 1 3 9 3 (p B S 2 1 6 )
PA H s+ A s+
B S 1 3 9 3 (2 p la s m id s )

24.

Плазмиды резистентности к мышьяку не
изменяют супрессивных свойств PGPR
Pseudomonas
P. a u r e o f a c ie n s
Bs1393
P. a u r e o f a c ie n s
Bs1393
P. c h l o r o r a p h i s
BS 1391
P. c h l o r o r a p h i s
B S 1 3 9 1 (p U C P 2 2 ::a r s R B C )
R h iz o c t o n ia
P. f lu o r e s c e n s
SPB 1217
P. f lu o r e s c e n s
S P B 1 2 1 7 (p U C P 2 2 ::a r s R B C )
P. a u r e o f a c i e n s
B S 1 3 9 3 ( p U C P 2 2 :: a r s R B C )
P. c h l o r o r a p h i s
B S 1 3 9 1 (p U C P 2 2 ::a r s R B C )
P. c h l o r o r a p h i s
BS 1391
R h iz o c t o n ia
P. f lu o r e s c e n s
SPB1217
P. f lu o r e s c e n s
S P B 1 2 1 7 (p U C P 2 2 ::a r s R B C )
P. a u r e o fa c i e n s
B S 1 3 9 3 ( p U C P 2 2 :: a r s R B C )
Супрессия in vitro фитопатогенных грибов Rhizoctonia solani
плазмидосодержащими штаммами PGPR Pseudomonas
Слева- среда без мышьяка;
Справа – концентрация мышьяка 500 мкг/мл

25.

P. chlororaphis Or3-3 (ОО)
ФКА / HCN / ИУК
P. fluorescens P2-1 (МО)
ГАП / ПАВ / ИУК
P. fluorescens A1* (МО)
ФКК / ИУК
P. fluorescens IC7* (ТО)
ФКК/ИУК
P. fluorescens 24 (ХМАО)
Антагонист (ФКК)
P. protegens P4-2 (МО)
HCN / ГАП / ПАВ / ИУК
P. protegens 14 (ХМАО)
Антагонист (Pf-5-like) / ГАП / (Cd/Zn)R
P. protegens 45 (ХМАО)
Антагонист (Pf-5-like) / ГАП / (Cd/Ni/Zn)R
P. putida P8-2 (МО)
ГАП / ИУК
P. putida O9-10 (МО)
(ФКК/ФКА) / HCN / ГАП / ИУК
P. brassicacearum Kr21 (КК)
HCN / ГАП / ИУК
P. lurida P6-1 (МО)
ГАП / ИУК
P. brenneri 11(ХМАО)
Антагонист / (Ni/Zn)R
P. brenneri 47 (ХМАО)
Антагонист (Pf-5-like) / ГАП / (Zn)R
P. veronii 27 (ХМАО)
Антагонист (Pf-5-like)
P. veronii 36 (ХМАО)
ГАП / (Cd/Zn)R
P. veronii 40 (ХМАО)
ГАП / (Zn)R
P. yamanorum 42(ХМАО)
Антагонист / ГАП / (Ni/Zn)R
P. yamanorum 48 (ХМАО)
(Pf-5-like) / ГАП / (Cd/Ni/Zn)R
P. chlororaphis (aur.) BS1393
ФКК/ОН-ФЕН / HCN / ГАП / ПАВ / ИУК

26.

Механизмы устойчивости
к мышьяку у
микроорганизмов

27.

ПОЛЕВЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ ПО ОПТИМИЗАЦИИ ФИТОРЕМЕДИАЦИИ НА
ЮГЕ РОССИИ
Kраснодарский лесхоз;
ИБФМ РАН