7.1. Лабораторная диагностика малярии

1.

2. Кулешова Светлана Вячеславовна, кафедра КЛД и ПА, г.Москва, 2018

7.1. Лабораторная диагностика малярии.
Методы выявления.
Кулешова Светлана Вячеславовна,
кафедра КЛД и ПА,
г.Москва, 2018

3.

4. АКТУАЛЬНОСТЬ. Основными целями Российской Федерации в области здравоохранения во взаимодействии с другими государствами -

АКТУАЛЬНОСТЬ.
Основными целями Российской Федерации в области
здравоохранения во взаимодействии с другими государствами участниками БРИКС, кроме взаимовыгодного сотрудничества для
укрепления отечественной системы здравоохранения, является
укрепление взаимовыгодного сотрудничества в более широком
контексте взаимодействия в рамках международных организаций, в
том числе Всемирной организации здравоохранения, ЮНЭЙДС,
Глобального фонда по борьбе со СПИДом, туберкулезом и
малярией и Глобального альянса по вакцинации и иммунизации
населения.
.

5.

В соответствии с Международными медикосанитарными правилами (2005 г.),
санитарно-эпидемиологическими
правилами СП 3.4.2318-08
"Санитарная
охрана
территории
Российской Федерации" перечень инфекционных
(паразитарных) болезней,
требующих
проведения
мероприятий
по
санитарной охране территории Российской
Федерации, включает 16 нозологических форм
инфекционных болезней, среди которых также
находится малярия.

6. Ежегодно растет число трудовых мигрантов, приезжающих в Российскую Федерацию. По итогам медицинского освидетельствования за

2013 год на наличие заболеваний,
представляющих опасность для окружающих, среди 1,5 млн.
иностранных граждан выявлено более 6,2 тысячи больных
инфекционными болезнями, в том числе 1,6 тысячи ВИЧинфицированных, около 2,5 тысячи больных туберкулезом, 2,2
тысячи больных инфекциями, передаваемыми половым путем.
Кроме того, зарегистрировано около 3 тысяч случаев заболевания
другими инфекционными болезнями (вирусные гепатиты,
кишечные инфекции и другие).

7. В целях соблюдения правовых и нормативных документов необходимо обеспечить : - обследование на малярию лиц, прибывших в течение

последних
трех лет из эндемичных по малярии территорий, обратившихся за
медицинской помощью при повышении у них температуры;
- обеспечить систематическое гигиеническое обучение населения
по предупреждению заражения малярией.

8. Согласно правилам "СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и

Согласно правилам "СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с
микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и
возбудителями паразитарных болезней. Санитарноэпидемиологические правила» возбудитель малярии относится
к третьей группе безопасности.
Выявление больных и паразитоносителей проводят медицинские
работники всех организаций здравоохранения, независимо от
организационно-правовых форм и форм собственности.
Возможность завоза малярии на территорию Российской
Федерации, появление вторичных от завозных, а также местных
случаев заболевания требует своевременной лабораторной
диагностики, необходимой для лечения и рационального
проведения противоэпидемических мероприятий

9. Больным малярией или паразитоносителем считается тот, у кого обнаружены малярийные паразиты при лабораторном исследовании крови

методами паразитологическими,
иммунологическими, молекулярно-диагностическими.

10. Обследованию на малярию подлежат:

• лица, прибывшие из эндемичных по малярии местностей или
посетившие эндемичные страны в течение последних трех лет,
при повышении температуры, с любым из следующих
симптомов на фоне температуры тела выше 37 °C:
недомогание, головная боль, увеличение печени, селезенки,
желтушность склер и кожных покровов, герпес, анемия;
• лица с неустановленным диагнозом, лихорадящие в течение 5
дней;
• - больные с установленным диагнозом, но с продолжающимися
периодическими подъемами температуры, несмотря на
проводимое специфическое лечение;
• - лица, проживающие в активном очаге, при любом повышении
температуры

11. Таким образом, становится ясно, что любая лаборатория страны может столкнуться с необходимостью исследовать мазок крови

пациента с подозрением на малярию.
ВАЖНО:
• Препараты крови от подозрительных на малярию лиц
исследуют в клинико-диагностических лабораториях лечебнопрофилактических организаций, лицензированных и имеющих
санитарно-эпидемиологическое заключение на проведение
работ с возбудителями III и IV групп патогенности в
установленном порядке.
• Все положительные и 10% от числа отрицательных препаратов
направляют для контрольного исследования и подтверждения в
областной, краевой или республиканский центр
Госсанэпиднадзора.
• Отрицательные препараты крови хранят в течение трех
месяцев.

12. Контрольные исследования в период лечения и оценка эффективности лечения осуществляется паразитологическими методами.

• При осуществлении паразитологической лабораторной
диагностики возбудителей малярии следует руководствоваться
методическими указаниями МУК 4.2.3222-14. 4.2. «Методы
контроля. Биологические и микробиологические факторы.
Лабораторная диагностика малярии и бабезиозов.
Методические указания».
• Иммунологическую и молекулярную (ПЦР) диагностику
проводят в соответствии с инструкцией к диагностическим
тестам.

13.

• Малярия - трансмиссивная протозойная болезнь
человека, характеризующаяся циклическим
течением, возможностью рецидивов, проявляющаяся
лихорадочными пароксизмами,
гепатоспленомегалией, анемией.
• Возбудители малярии относятся к типу простейших
(Protozoa), классу споровиков (Sporozoa), семейству
плазмодид (Plasmodiidae), род плазмодиев
(Рlasmodium).

14. В настоящее время малярия остается наиболее широко распространенной в мире тропической болезнью и является серьезнейшей

проблемой
здравоохранения для 110 стран Азии, Африки,
Южной Америки.

15. Возбудители малярии

• Малярийные паразиты рода Plasmodium передаются
людям через укусы инфицированных самок комаров
вида Anopheles, называемых «переносчиками
малярии». Существует пять видов паразитов,
которые вызывают малярию у человека, и два таких
вида – P. falciparum и P.vivax – создают наибольшую
угрозу.
• В большинстве случаев малярия передается через
укусы самок комаров Anopheles. Около 30 видов
являются значимыми переносчиками малярии. Все
значимые виды переносчиков кусают в сумерках и на
рассвете. Интенсивность передачи зависит от
факторов, связанных с паразитом, переносчиком,
организмом человека-хозяина и окружающей средой.

16.

• Комары Anopheles откладывают в воду яйца, из них
выводятся личинки, которые в конечном счете
превращаются во взрослых комаров. Самкам
комаров кровь необходима для откладывания яиц.
Каждый вид комаров Anopheles имеет свою водную
среду обитания; некоторые, например, предпочитают
небольшие, мелкие скопления пресной воды, такие
как лужи и следы от копыт, которые в дождливые
сезоны в тропических странах имеются в изобилии.

17. Виды плазмодиев

• В настоящее время известно более 60 видов
плазмодиев малярии. Малярию человека
вызывают четыре вида: Рlasmodium vivax –
возбудитель трёхдневной малярии, Р. malariae –
возбудитель четырехдневной малярии, Р.
falciparum – возбудитель тропической малярии и
Р. ovale – возбудитель трёхдневной овалемалярии.
• В экспериментальных и иногда в естественных условиях
возможно заражение человека зоонозными видами плазмодиев
обезьян (Р. knowlesi, Р.cynomolgi и др.). Тяжёлые случаи
малярии у людей, вызванной P. knowlesi, стали
регистрироваться с 2004 г. среди туристов в Юго-Восточной
Азии.

18. ТРЕХДНЕВНАЯ МАЛЯРИЯ.

• Возбудитель обладает способностью вызывать
заболевание после короткой (10-21-й день) и
длительной (6-13 мес) инкубации в зависимости от
типа спорозоита. Трехдневная малярия
характеризуется длительным доброкачественным
течением. Повторные приступы (отдаленные
рецидивы) наступают после латентного периода в
несколько месяцев (3-6-14) и даже 3-4 года.

19.

У впервые заболевших неиммунных лиц болезнь начинается с продромы недомогания, слабости, головной боли, ломоты в спине, конечностях. В
большинстве случаев типичным приступам малярии предшествует 2-3дневное повышение температуры тела до 38-39°С неправильного типа.
В дальнейшем приступы малярии клинически четко очерчены, наступают
через равные интервалы и чаще в одно и то же время дня (между 11 и 15
ч). При среднетяжелом и тяжелом течении заболевания во время озноба у
больного отмечаются выраженная слабость, резкая головная боль,
ломящие боли в крупных суставах и пояснице, учащенное дыхание,
повторная рвота. Больные ощущают потрясающий озноб, холод. Лицо
бледнеет. Температура тела быстро достигает 38-40°С. После озноба
начинается жар. Лицо краснеет, кожа туловища становится горячей.
Больные жалуются на головную боль, жажду, тошноту, нарастает
тахикардия. Артериальное давление снижается до 105/50-90/40 мм рт. ст.,
над легкими выслушиваются сухие хрипы, указывающие на развитие
бронхита. Почти у всех больных отмечаются умеренное вздутие живота,
жидкий стул. Увеличение печени и селезенки удается выявить уже на
первой неделе заболевания. Анемия развивается постепенно.

20. ЧЕТЫРЕХДНЕВНАЯ МАЛЯРИЯ.

• Инкубационный период в случаях естественного
заражения составляет 21-40 дней, при внутривенном
заражении шизонтами - от нескольких дней до
нескольких месяцев. Тканевая шизогония
наблюдается только в инкубационном периоде.
• Отличительной чертой возбудителя четырехдневной
малярии является способность в течение
длительного времени (десятки лет) сохраняться в
организме человека после перенесенной болезни.

21.

• Продромальные симптомы наблюдаются относительно
редко и напоминают продрому при трехдневной
малярии. Характерны типичные пароксизмы лихорадки,
продолжительностью около 13 ч, с последующим
правильным их чередованием на каждый четвертый
день. Селезенка увеличивается медленно и
пальпируется только через 2 нед от начала болезни.
• Анемия при этой форме малярии развивается
постепенно и не достигает уровня, характерного для
трехдневной и тропической малярии, что объясняется
относительно низким уровнем паразитемии.
Длительность клинических проявлений нелеченной
четырехдневной малярии несколько месяцев, пока не
наступает спонтанное выздоровление.

22. Лабораторная диагностика малярии

• Диагностика малярии основана на
обнаружении кровяных форм паразитов
(трофозоиты, шизонты и гаметоциты)
при микроскопическом исследовании
крови.
• В настоящее время не предложено
способов обнаружения гипнозоитов: ни
иммунологических, ни
паразитологических.

23.

• Для обнаружения эритроцитарных форм плазмодиев
и определения их вида используют препараты крови,
приготовленные методом тонкого мазка и толстой
капли, окрашенные по методу Романовского-Гимзы.
• Оба метода, имеющие свои преимущества и
недостатки, являются взаимодополняющими.
• Основной метод - толстая капля.

24. Толстая капля

• В толстой капле форменные элементы
располагаются многослойно.
• Это значительно повышает шанс обнаружения
паразитов, особенно при низкой паразитемии
• Толстую каплю окрашивают нефиксированной;
• это приводит к гемолизу эритроцитов, в
результате чего паразиты становятся
доступными для выявления.
• Однако при этом паразиты подвергаются
деформации.

25. Толстая капля

• Толстая капля может позволить
выявить и других паразитов крови:
бабезий, трипаносом,
микрофилярий, спирохет

26. Толстая капля – контроль качества препарата:

• Толщина препарата должна быть такой,
чтобы через нее после высыхания
просматривался газетный текст.
• Слишком толстая капля может
оторваться от стекла при высушивании;
такой препарат не пригоден для
исследования. Маркировка препарата
производится на мазке крови между
каплями.

27. Толстая капля – контроль качества препарата:

• Независимо от методики приготовления
показателем достаточного содержания
крови в толстой капле является
обнаружение в 1 поле зрения
микроскопа в среднем 10-20
лейкоцитов (увеличение: объектив х90х100, окуляр х7; х8; х10)

28. Тонкий мазок

• В тонком мазке, фиксированном до
окраски, сохраняются морфологические
особенности, присущие данному виду
паразита, и характерные изменения
пораженного эритроцита. Тонкий мазок
крови делают в дополнение к толстой
капле

29. Толстая капля на мазке

• Толстая капля на мазке имеет преимущества, так как
на мазке чаще сохраняются не полностью
гемолизированные эритроциты, что может помогать
дифференциальному диагнозу, поскольку в мазке,
несмотря на гемолиз, могут сохраняться
азурофильные элементы в эритроцитах (зернистость
Шюффнера, Джеймса и пятнистость Маурера). Капля
крови, нанесенная на мазок, более прочно
прикрепляется, чем нанесенная непосредственно на
предметное стекло.

30. Дифференциальное определение вида малярийного паразита проводят по совокупности признаков:

• морфологии паразита,
• состоянию пораженных эритроцитов,
• соотношению стадий паразита,
обнаруженных в периферической
крови.

31.

• в настоящее время широко
используются для лабораторной
диагностики малярии
иммунологические (экспресс-тесты) и
молекулярно-биологические методы.
• данные методы являются
взаимодополняющими,
• но "золотым" стандартом остается
метод микроскопии толстой капли.

32. Взятие крови из пальца - фельдшер

• Кровь для паразитологического исследования берут
из пальца руки (у взрослых - обычно безымянного, у
детей - из большого), у новорожденных детей - из
большого пальца ноги (но не мочки уха!).
• Использовать венозную кровь можно только в
случаях, если известно, что в качестве
антикоагулянта применяли ЭДТА
(этилендиаминтетрауксусная кислота), другие
антикоагулянты, такие как гепарин, цитрат, не
должны быть использованы, так как они могут влиять
на морфологию паразитов.

33. Преаналитический этап.

- Стандарт ИСО – ГОСТ Р 53079.4-2008.
Национальный стандарт Российской
Федерации. Технологии лабораторные
клинические. Обеспечение качества
клинических лабораторных исследований.
Часть 4. Правила ведения
преаналитического этапа (утв. и введен в
действие Приказом Ростехрегулирования
от 18.12.2008 N 554-ст)

34. Виды пробирок для взятия крови из вены Vacuette.

Вакуумная пробирка Vacuette – стерильная
закрытая крышкой пробирка,
содержащая разрежение воздуха (пробирка
произведена в заводских условиях),
что позволяет производить процедуру взятия
крови непосредственно
сразу в пробирку. Пробирка может содержать
реактивы и другие добавки
в строго определенном соотношении.

35. Виды пробирок для взятия крови из вены Vacuette - цветовая маркировка крышек и этикеток.

Виды пробирок для взятия крови из вены Vacuette цветовая маркировка крышек и этикеток.
на приготовление мазков
молекулярно-генетические исследования крови метдом ПЦР
Строго до метки!
пробирка с ЭДТА (сиреневая крышка и
маркировка)

36. Виды пробирок для взятия крови из вены Vacuette - цветовая маркировка крышек и этикеток.

Виды пробирок для взятия крови из вены Vacuette цветовая маркировка крышек и этикеток.
Пробирка с активатором свертывания (красная крышка и маркировка)
и/ или с разделительным гелем, с шариками – для получения
сыворотки:
-диагностика возбудителей по антителам

37. Преаналитический этап – виды микропробирок для взятия соскобов на ПЦР-исследований – эппендорфы:

Пробирки со
специальным
раствором – для
консервации клеток или
наоборот,
для лизиса клеток и
ядер

38. Преаналитический этап – маркировка пробирок и емкостей. Примеры правильной маркировки:

39. Подготовка стекол - фельдшер

• Подготовке предметных стекол должно уделяться
особое внимание.
• В ряде нормативных документов есть указания на
использование ТОЛЬКО СТЕРИЛЬНЫХ
ПРЕДМЕТНЫХ СТЕКОЛ.

40.

• Стекла, многократно бывшие в употреблении, для
приготовления препаратов крови использовать
запрещается, так как имеющиеся на них царапины
могут затруднить диагностику и даже привести к
диагностическим ошибкам. Использование новых
стекол рентабельнее, так как устраняется
трудоемкий ручной процесс и гарантируется
качество.
• Если новые стекла поставлены неочищенными, то их
очищают

41.

• 1. Новые предметные стекла замачивают в мыльном растворе, нагретом до 60
°С, не кипятят.
2. Каждое предметное стекло протирают ветошью с обеих сторон в этом
растворе.
3. Промывают в проточной воде в течение 2-3 ч, периодически перемешивая.
4. Погружают в дистиллированную воду на 30 мин; при отсутствии возможности
протереть стекла в тот же день, их оставляют в холодильнике в
дистиллированной воде до следующего дня.
5. Качество отмывки предметных стекол от щелочи проверяют нанесением на
предметное стекло 1 капли фенолфталеина - появление розовой окраски
раствора свидетельствует о недостаточной отмывке от щелочи.
6. Стекла вытирают чистой хлопчатобумажной тканью и помещают для
обезжиривания в смесь Никифорова (из расчета 1 мл смеси на 1 стекло) или
спирт 70°, где они могут храниться в течение длительного времени.
7. Извлеченные пинцетом из смеси Никифорова стекла протирают
хлопчатобумажной материей, заворачивают в чистую гладкую не ворсистую
бумагу не большими партиями, оптимально по 6 штук - на одного больного.

42.

• Во время манипуляций с чистыми
предметными стеклами их следует
брать только за боковые поверхности
или пинцетом.

43. Окрашивание мазков

• Для окрашивания мазков используются
красители, как для рутинных
гематологических методик (раствор
краски Романовского-Гимзы)

44. Кровь из пальца

• Периферическую кровь для
исследования берут вне зависимости от
температуры тела и клинических
проявлений.
• Распространено неверное мнение, что
для обнаружения малярийных
паразитов кровь у больного следует
брать на высоте приступа.

45. Кровь из пальца

• Для прокола кожи пальца используют стерильные
одноразовые скарификаторы или специальные
стерильные разового использования иглы.
• Перед проколом кожу пальца тщательно протирают
ватным тампоном, смоченным в 70%-м спирте, чем
достигается не только предупреждение
инфицирования места прокола, но и попадание с
кожи пальца бактерий, различных посторонних
частиц на препарат крови, которые могут затруднить
диагностику при микроскопии.

46. Кровь из пальца

• Первую каплю крови, выступившую после прокола,
вытирают сухим стерильным ватным тампоном, чтобы
избежать фиксации эритроцитов остатками спирта,
которым дезинфицировали кожу.
• Последующие капли (выступающие самостоятельно
или при легком надавливании на палец массирующими
движениями) используются для приготовления
препаратов крови.
• Кровь набирают в стерильный сухой гематологический
капилляр, из которого быстро переносят на предметное
стекло, либо выступившую кровь непосредственно из
прокола пальца наносят на предметные стекла .

47.

• От одного пациента готовят не менее 3 стекол с
толстыми каплями и 3 тонких мазка крови.
• Рекомендуется первоначально окрасить по одному
стеклу, чтобы иметь возможность исправить дефекты
окраски.

48. Микроскопия- врач

• Препараты крови исследуют под
микроскопом с применением масляной
иммерсии: объектив х90 или х100, окуляр х7,
х8 или х10, с поднятым конденсором и
полностью открытой диафрагмой. С
диагностической целью сначала
микроскопируют толстую каплю, затем, при
необходимости, для уточнения вида
возбудителя - тонкий мазок.

49.

• Препарат считается отрицательным,
если паразиты не обнаружены после
просмотра 100 полей зрения толстой
капли.
• Отрицательный диагноз не может
считаться достоверным, если
исследован только тонкий мазок.

50. После первого обнаружения паразитов исследование продолжают для того чтобы:

• - определить видовую принадлежность паразитов;
• - указать, какие стадии паразитов найдены (только в
случае P. falciparum);
• - указать наличие или отсутствие гаметоцитов в
случае тропической малярии;
• - указать количество паразитов, руководствуясь
одним из предлагаемых ниже методов;
• - не пропустить смешанную инфекцию.

51. Последовательность установления диагноза при малярии следующая:

• решается вопрос, есть ли паразиты;
• решается вопрос, не P. falciparum ли это;
• находят характерные стадии, позволяющие
дифференцировать три остальных вида;
• определяют вид;
• если установлено, что речь идет о P. falciparum,
решают, присутствуют ли гаметоциты.

52.

53.

54. Алгоритм действий при обнаружении малярии:

• Все положительные и 10% от числа
отрицательных препаратов направляют
для контрольного исследования и
подтверждения в областной, краевой
или республиканский центр
Госсанэпиднадзора.
• Отрицательные препараты крови
хранят в течение трех месяцев.

55.

56.

• О каждом случае малярии медицинские работники медицинских
организаций (государственной, муниципальной и частной
системы здравоохранения) в течение 12 часов направляют
экстренное извещение в территориальный орган федерального
органа исполнительной власти, уполномоченного осуществлять
федеральный государственный санитарно-эпидемиологический
надзор.

57. Взаимодействие с официальными органами.

• Каждый случай малярии подлежит регистрации и учету в
журнале учета инфекционных заболеваний по месту их
выявления.
• Задача любого медицинского учреждения обеспечить
качественное проведение лабораторной диагностики малярии.
• В случае обнаружения малярии учреждение обязано
направлять препараты – «толстую» каплю и тонкий мазок - в
Референс-центр по мониторингу за малярией (Государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования
Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова
Министерства здравоохранения Российской Федерации, в недельный срок).

58.

• Экспресс-тест для определения малярии (на
примере HEXAGON MALARIA COMBI)

59. Назначение и особенности

Данная тест система используется для диагностики малярии,
вызванной Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale. Только
для in vitro диагностики.
Экспресс-тест HEXAGON MALARIA COMBI предназначен для быстрого
качественного определения богатого гистидином протеина-2 (HRP2),
выделенного из Plasmodium falciparum, и, специфичной для всех видов
Plasmodium, альдолазы.

60. Диагностическая чувствительность и специфичность

• Чувствительность теста HEXAGON
MALARIA COMBI при наличии > 100
паразитов/мкл крови составляет
• 99,2% для P. falciparum и 90,2 % - для
P. vivax.
• Специфичность составляет 100%.

61.

62. Учет результатов

Положительный результат (Рис. 2 и 3)
Результат считается положительным, указывающим на наличие в образце HRP2 P.
falciparum, при наличии одной красно-фиолетовой тестовой линии (1) в нижней части тестполоски или двух красно-фиолетовых тестовых линий (1 и 2) в дополнение к контрольной
линии (С).
Две окрашенные полосы также могут быть видны при смешанной инфекции (P. falciparum +
другие виды плазмодиев).
Возможна разница в интенсивности окрашивания тестовых (1 и 2) и контрольной (С) линий,
однако это не имеет значения для интерпретации результатов.
HEXAGON MALARIA COMBI, HUMAN GmbH
Положительный результат (Рис. 4)
Результат считается положительным при наличии красно-фиолетовой тестовой линии (2)
сразу за контрольной линией (С), указывая на наличие в образце наличие антигенов P.
vivax или других не-P. falciparum видов малярийного плазмодия, P. malariae, P. ovale, или
наличие смешанной инфекции двух или трех видов плазмодия.
Неправильный результат (Рис. 5)
Отсутствие контрольной окрашенной линии (С), даже при наличии тестовой линии,
свидетельствует о неправильном выполнении теста или непригодности тест-полоски. В
этом случае следует провести повторное исследование с другой тестовой полоской.

63. Спасибо за внимание!

кафедра КЛД ИПК ФМБА,
denisova_ov@inbox.ru