L8

1. УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

1

2. Влияние температуры

По отношению к температуре бактерии подразделяют на психрофилы (температурный оптимум — 5–10С),
мезофилы (температурный оптимум — 25–37С), термофилы (температурный оптимум —45–90С).
Болезнетворные для млекопитающих бактерииотносятся к группе мезофилов, но температурные оптимумы
для отдельных возбудителей в пределах указанного диапазона могут варьироваться. Например,
температурный оптимум для иерсиний составляет 22–28С, лептоспир —28–30С, эшерихий — 37–38С.
Варьирование температуры инкубирования может влиять на метаболизм, что в отдельных случаях приводит к
изменению свойств микроба. Например, патогенные листерии хорошо растут при 37С,но жгутики образуют
только при 20–25С.
Оптимальную температуру обеспечивают культивированием микроорганизмов в термостатах или
термостатных комнатах, где с помощью терморегуляторов инагревательных элементов поддерживается
оптимальная температура. Термостат — это шкаф с двойными стенками, пространство между которыми
заполнено воздухомили водой; снабжен устройством для поддержания постоянной температуры в диапазоне
28–43С. В воздушном термостате часто наблюдаются резкие колебания температуры, так как при его
открывании теплый воздух быстро замещается холодным. Более стабильная температура поддерживается в
термостате с водяной рубашкой. В ходе культивирования в термостате рекомендуют измерять температуру в
различных его участках, так как она может существенно отличаться. В воздушном термостате культуральные
сосуды размещают таким образом, чтобы они не попали в «мертвое» воздушное пространство, слабо
затрагиваемое конвекционными потоками. Любой термостат желательно как можно реже открывать в
процессе инкубирования.
2

3.

.
Схема №1.
Источник [2].
3

4.

Кривые роста (в зависимости от температуры) и температурные
оптимумы различных групп микроорганизмов.
Схема №2.
Источник [3].
4

5. Влияние света

На рост болезнетворных бактерий светне оказывает существенного влияния, поскольку они не являются
фототрофами. Их культивируют в темноте. Прямые солнечные лучи убивают все микроорганизмы, кроме
фототрофных. Рассеянный свет большинство бактерий переносят сравнительно легко. Но в любом случае
культуральные сосуды с микроорганизмами длительное время подвергать воздействию световых лучей
нежелательно.
Влияние состава газовой среды. Культивирование облигатных аэробов, микроаэрофилов и
факультативных анаэробов. Облигатные аэробы требуют для своего роста присутствия молекулярного
кислорода в количестве 21%, что соответствует его концентрации в обычной атмосфере.
Существует группа аэробов (микроаэрофилы), требующих для роста меньшего содержания кислорода (5–
6%). Факультативные анаэробы способны расти как в аэробных, так и анаэробных условиях, обычно их
культивируют, как и аэробные микроорганизмы.
Аэробные бактерии выращивают в тонком слое жидкой или плотной питательной среды. При
культивировании в жидкой питательной среде пробирки размещают внаклонном положении, что увеличивает
площадь соприкосновения среды и воздуха. Пробки в пробирках с той же целью используют рыхлые. В
жидких средах аэробы растут преимущественно на поверхности, факультативные анаэробы — по всей толще
питательной среды. При использовании плотных сред их разливают тонким слоем в чашки Петри или
скашивают в бактериологических пробирках; посев производят на поверхность питательной среды.
5

6. Культивирование микроаэрофилов

Культивирование микроаэрофилов проводят в специальных герметически закрываюшихся термостатах,
соединенных с баллоном, содержащим углекислый газ СО2. Послезагрузки посевов необходимую часть воздуха
в термостатезамещают газом (СО2), что обеспечивает микроаэрофильные условия. Наиболее доступным
способом является выращивание микроаэрофилов в полужидком агаре (0,15–0,4%), который наливают в
пробирку высоким столбиком. В среде создают градиент кислорода: максимум его содержания у поверхности
среды и минимум — на дне пробирки. Материал или культуру засевают уколом. Микроаэрофилы растут в
виде тонкого диска несколько ниже поверхности среды в зоне оптимальной концентрации кислорода.
Культивирование капнофилов. Некоторые виды бактерий, особенно в первых генерациях, не могут
размножаться без повышенного содержания углекислого газа в составе газовой среды (бруцеллы, нейссерии).
Для культивирования капнофилов используют следующие приемы. Чашки, пробирки с посевами помещают в
анаэростат,откачивают из него необходимый объем воздуха (под контролем манометра), затем добавляют из
баллона углекислый газ до восстановления на манометре атмосферного давления. Посевы помешают в
эксикатор, туда же ставят горящую свечу и закрывают крышку. После того как свеча погаснет, концентрация
углекислого газа в эксикаторе составляет около 2,5%, а кислорода — 17%.
6

7.

В эксикатор или анаэростат вместе с посевами помещают склянку с 0,48 г натрия бикарбоната и 5 мл 25%ного раствора серной кислоты из расчета 100 мл объема сосуда. Концентрацию углекислого газа в атмосфере
сосуда можно определить следующим способом.
В сосуд помещают пробирку с 2–3 мл 0,1%-ного раствора бромтимолового синего. Цвет смеси в
зависимости от концентрации СО2 в атмосфере меняется следующим образом: синий — < 5% СO2, синезеленый — 5% СО2, зеленый — 10% СO2, зелено-желтый — 15% СО 2, желтый —20% СО 2.
Выпускают специальные герметические контейнеры и газпакеты с реагентами, которые после добавления
воды обеспечивают накопление в камере необходимого количества углекислоты.
Культивирование облигатных анаэробов. Особенности приготовления питательных сред для выращивания
анаэробов включают в первую очередь удаление из них растворенного кислорода и поддержание при помощи
восстановителей оптимального окислительно-восстановительного потенциала (ОКВП) среды. В качестве
восстановителейвключают в состав среды глюкозу (0,5%), натрия тиогликолат (0,1%), цистеин (0,1%)
аскорбиновую кислоту (0,1%), кусочки вареной печени, куриный белок. Однако, чтобы сохранить ОКВП среды
на нужном уровне, необходимо максимально снизить или даже исключить в последующем контакт среды и
клеток бактерий с кислородом воздуха, который для анаэробов токсичен. Для этого применяют методические
приемы.
7

8.

Классификация
микроорганизмов по степени
аэробности и анаэробности
Схема №3.
Источник [4].
8

9. Культивирование посевов в термостате в условиях обычной атмосферы

Культивирование можно осуществлять в условиях обычной атмосферы, но при этом уменьшают контакт
клеток микроорганизмов с кислородом воздуха,что достигается различными способами. Питательную среду
загущают для уменьшения диффузии кислорода воздуха агар-агаром (0,1–0,2%). Посев производят уколом в
среду. В толще среды создаются условия анаэробиоза. Поверхность жидкой или полужидкой питательной
среды покрывают стерильным вазелиновым маслом, что предотвращает ее контакт с воздухом. Таким образом
готовят среду Китта– Тароцци (мясо-пептонный печеночный бульон). Ее основой служит печеночная вода,
которую готовят путем кипячения в воде мелких кусочков говяжьей печени в соотношении 1:1. Печеночную
воду смешивают с МПБ в соотношении 1:2, кипятят, устанавливают pH 7,8–8,2, кипятят 15 мин, фильтруют
через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 10 мл, добавляют кусочки печени (восстановитель), вносят
по 2 мл вазелинового масла и стерилизуют 20–40 мин при 120С.
Готовые питательные среды для анаэробов не рекомендуется хранить в холодильнике, так как при низкой
температуре увеличивается растворимость кислорода. Перед посевом среды регенерируют: прогревают в
кипящей водяной бане для удаления растворенного кислорода, затем быстро охлаждают и производят посев.
9

10. Выращивание анаэробов в толще плотной питательной среды

Исследуемый материал вносят в расплавленную и охлажденную агаровую среду, которую затем помещают в
трубки Бурри или чашки Петри. Данные методы подходят для выделения чистых культур анаэробов, так как
удается получить изолированные колонии бактерий в толще агаровой среды.Стеклянные трубки Бурри имеют
диаметр 1,0–1,5 см и длину 20–25 см. Концы трубок закрывают ватными пробками, а сами трубки стерилизуют.
Перед посевом одну из ватных пробок заменяют на стерильную резиновую, через другой конец трубки вносят
среду с посевным материалом и тоже закрывают его резиновой пробкой. При выращивании анаэробов в толще
агаровой среды в чашках Петри расплавленную агаровую среду с материалом наливают в крышку чашки.
После застывания среды сверху помещают вторую половину чашки (дном вниз) и плотно прижимают ее к
поверхности среды. Зазор между стенками крышки и дном чашки Петри заливают стерильным парафином.
10

11.

Посев культуры микроорганизмов на поверхность
плотной питательной среды шпателем
1. Шпатель Дригальского
2. Посев
3. Рост микроорганизмов после посева
Схема №4.
Источник [5].
11

12. Культивирование анаэробов в камерах с измененным составом газовой среды

Выращивание в анаэростатах. Анаэростаты представляют собой металлические камеры с герметично
прилегающей крышкой, оснащенной манометром и краном для отведения воздуха. В анаэростатах помещается
несколько чашек Петри. Воздух из анаэростата откачивают при помощи ручного или электрического
вакуумного насоса. Например, анаэробы рода Clostridium растут при уровне вакуума 3–15 мм ртутного столба.
О степени разрежения воздуха в анаэростате судят по показанию манометра. После достижения необходимого
уровня вакуума перекрывают вентиль и анаэростат с посевами помещают в термостат.
Во избежание подсасывания воздуха рекомендуется после его удаления заполнять анаэростат газовой
смесью, состоящей из азота(80–90%) и углекислоты (10–20%), до давления 500 мм ртутного столба. Такое
выравнивание давления внутри анаэростата, кроме того, предотвращает разрыв клеток бактерий за счет
внутреннего тургорного давления.
Выращивание в камерах с изменением газовой среды химическими методами. Воздух из камеры не
удаляют. В камере помещают химические соединения, например, в виде пакетов с генераторами Н2 + СO2
(система «Газ-Pack»). Газогенерирующие пакеты содержат таблетку лимонной кислоты с натрием
бикарбонатом и таблетку с натрием боргидридом (возможны другие смеси). Перед тем как закрыть крышку
контейнера, срезают угол пакета, вливают в него 10 мл воды. В ходе химических реакций в замкнутом
пространстве контейнера поглощается кислород, выделяются водород и углекислый газ, что обеспечивает
необходимые условия анаэробиоза. Полноту поглощения кислорода в контейнерах можно контролировать при
помощи окислительно-восстановительного индикатора, который представляет смесь равных объемов 0,024%ного NaOH, 0,015%-ного водного метиленового синего и 6%-ного раствора глюкозы с добавлением
антисептика. Смесь наливают в пробирку, нагревают до обесцвечивания, быстро охлаждают и помещают в
анаэростат. В анаэробных условиях раствор остается бесцветным.
12

13. Методы, основанные на других биологических особенностях микроорганизмов

При выделении чистых культур некоторых видов бактерий используют их иные биологические
особенности. Например, способность микроорганизма расти при низких (листерии) или высоких
(термофильные бактерии) температурах, которые лежат за пр-делами температурных диапазонов
сопутствующих видов бактерий. Для выделения культуры Р.vulgaris используют способность данного вида
давать ползучий рост (роение) на поверхности плотной питательной среды. С этой целью материал,
содержащий Р.vulgaris, засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенным МПА, не касаясь
поверхности среды (метод Шукевича). Сопутствующая микрофлора растет в нижней части питательной среды,
апротей в виде прозрачной пленки распространяется вверх ,откуда отвивают его чистую культуру. Для
выделения C.tetani материал засевают точечно на плотную питательную среду в чашках Петри и после
выращивания отвивают культуру с периферии ползучего роста.
13

14. Общие требования и классификация питательных сред

Культивирование микроорганизмов проводят при диагностике инфекционных болезней, а также
изготовлении различных биопрепаратов: вакцины, диагностические антигены. Для выращивания каждого
вида микроорганизмов разработаны оптимальные питательные среды с учетом их физиолого-биохимических
свойств.
Питательные среды любого типа должны отвечать ряду общих требований:
- содержать все необходимые для роста микроорганизмов биохимические факторы (источники углерода,
азота, фосфора, витаминов);
- иметь оптимальные значения ряда биофизических показателей (рН, окислительно-восстановительный
потенциал, изотоничность, наличие активной воды);
- быть стерильными.
По составу среды подразделяют на натуральные и синтетические. Натуральные среды приготавливаются
из животного или растительного сырья. К числу таких сред относят большинство питательных сред для
культивирования: мясопептонный бульон, агар, молоко, отвары, экстракты.
Синтетические питательные среды составлены из известных химических соединений: соли, углеводы,
аминокислоты, витамины в оптимальном количественном соотношении. Среды такого типа используют для
выращивания микробной массы, максимально освобожденной от балластных органических соединений,
которые входят в состав натуральных сред.
По консистенции питательные среды подразделяют наплотные, полужидкие и жидкие.
Жидкие среды готовят на основе гидролизатов, экстрактов, растворов исходных продуктов.
14

15.

При конструировании плотных сред необходимую консистенцию придают добавлением в среду различных
уплотнителей. В этом качестве используют агар-агар полисахарид, продукт переработки некоторых морских
водорослей, который плавится при 80–90С, затвердевает при 40С. Для получения плотных сред агар-агар
добавляют в количестве 1,5–3%, полужидких — 0,3–0,5%. Часто уплотнителем служит желатина экстракт из
тканей, содержащих большое количество коллагена (кости, хрящи,сухожилия). Желатиновый гель плавится
при 25С, что делает его непригодным для выращивания микроорганизмов с температурным оптимумом 37–
38С. Кроме того, ряд «бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину. В
питательные среды вносят 10–20%-ные желатины.
По целевому назначению питательные среды подразделяют на следующие основные группы.
Общепотребительные среды предназначены для культивирования большой группы неприхотливых
микроорганизмов, часто они служат основой для изготовления сред других типов. Специальные питательные
среды разработаны с учетом ростовых потребностей конкретного вида или группы микроорганизмов.
Элективные среды сконструированы для избирательного выделения и накопления микроорганизмов
определенного вида из материалов, содержащих несколько видов микробов. В такие среды включают
антибиотики, красители, тормозящие размножение сопутствующей микрофлоры,что обеспечивает
преимущественный рост идентифицируемого микроорганизма. По консистенции эти среды могут быть
плотными и жидкими. Жидкие элективные среды называют средами обогащения или накопления, их
применяют, когда ставят цель увеличить количество определяемого микроорганизма в смешанной популяции.
15

16.

Классификация питательных сред
По
консистенции
Твердые
2%
Жидкие
Полужидкие
0,6%
Селективные
По составу
Простые
По
назначению
Специа
льные
Диффер
енциаль
нодиагнос
тически
е
Для выявления
протеолитических свойств
Сложные
Схема №5.
Для
обнаружения
сахаролитических ферментов
Источник [6].
16

17.

Классификация питательных сред по назначению
Схема №6.
Источник [6].
17

18.

Дифференциально-диагностические среды используют для выявления у микроорганизмов различных
ферментов. По консистенции такие среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными. Классическим
примером сред такого типа являются среды Гисса для выявления ферментов, расщепляющих тот или иной
углевод. В состав сред Гисса входит основная питательная среда (пептонная вода), обеспечивающая рост
изучаемого микроорганизма, субстрат для фермента (углевод) и индикатор, по изменению цвета которого судят
о сдвиге pH среды (закисление) в результате расщепления углевода. Существует много дифференциальнодиагностических сред с иными, чем углеводы, субстратами.
Исходными компонентами для приготовления питательных сред в большинстве случаев служат такие
полуфабрикаты, как мясная вода, перевар Хоттингера, гидролизаты различных животных, растительных,
микробных продуктов.
Мясная вода. Мясо освобождают от жира, фасций, костей, измельчают в мясорубке. К 1 кг фарша
добавляют 2 л дистиллированной воды, кипятят в течение одного часа, отстаивают, фильтруют через полотно
или бумагу, фильтрат доливают водой до исходного объема, разливают по емкостям и стерилизуют 30–40 мин
при 120С.
18

19.

Перевар Хоттингера. Готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир, фасции,
сухожилия измельчают, заливают кипящей водой в соотношении 1:2, кипятят, охлаждают до 45С, добавляют
фермент панкреатин, подщелачивают раствором натрия карбоната до pH 7,8–8,0, что обеспечивает
максимальную активность фермента. Смесь встряхивают, вносят для консервирования хлороформ (10 мл/л),
емкость плотно закрывают пробкой, выдерживают 10 суток в тепле. После окончания гидролиза перевар
фильтруют, разливают в емкости (флаконы) истерилизуют для хранения впрок.
По аналогичному принципу готовят ферментативные гидролизаты других исходных продуктов.
Гидролизаты можно получать также путем кислотного гидролиза (НCl) продуктов в автоклаве при 1,5 атм.
Мясопептонный бульон (МПБ). К 1 л мясной водыдобавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида,
устанавливают необходимый pH (7,4–7,6) дробным добавлением 10%-ного раствора натрия гидроксида. Бульон
фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробирками стерилизуют при 120С в течение 15–20
мин.
Мясопептонный агар (МПА). К МПБ добавляют 2–3% промытого, мелко нарезанного агар-агара,
нагревают смесь до расплавления агара, в горячем виде контролируют pH, доводят его до нужного уровня (7,2–
7,6), среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
Профильтрованный горячий агар разливают по пробиркам, колбам и стерилизуют при 1 атм в течение 20–
30 мин.
19

20.

Перед использованием МПА расплавляют в пробирках, пробирки оставляют до уплотнения среды в
наклонном положении, что позволяет получить значительную скошенную поверхность агара для посева
микроорганизмов. Широко используют культивирование микроорганизмов на плотных питательных средах в
чашках Петри. Диаметр стандартной чашки Петри около 10 см, выпускают чашки меньшего и большего
диаметров, а также одноразовые пластиковые. В стандартные стерильные чашки Петри над пламенем горелки
наливают около 20 мл расплавленного и охлажденного до 45–50С питательного агара, чашки помещают на
горизонтальную поверхность до его застывания.
Сухие питательные среды. В настоящее время в диагностических лабораториях в большинстве случаях
используют готовые сухие питательные среды, выпускаемые предприятиями биологической промышленности
в виде порошков. Например, широко применяют питательный бульон на основе триптического гидролизата
кильки. Состав среды(г/л): триптический гидролизат кильки — 10,05; натрия хлорид — 4,95. Приготовление
среды: навеску порошка массой 15 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин, устанавливают
pH 7,3, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют при 120С в течение 20–30
мин.
Выделить питательный агар на основе ферментативного гидролизата кормовых дрожжей. Состав среды
(г/л): гидролизат дрожжей — 12,0; агар — 12,5; натрия хлорид —5,5. Приготовление среды: навеску порошка
массой 36 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 3 мин, устанавливают pH 7,3, фильтруют через
ватный фильтр, стерилизуют при 120С в течение 20 мин.
20

21.

Для активизации роста некоторых болезнетворных микроорганизмов питательный бульон и агар часто
обогащают цельной кровью, сывороткой крови, углеводами. При изготовлении сывороточного и кровяного
агаров к расплавленному (45–50⁰С) стерильному агару добавляют 5–10% стерильной дефибринированной
крови барана, сыворотки крови (лошади, крупного рогатого скота, кролика). Среду перемешивают, разливают
по пробиркам, чашкам Петри. Углеводы (глюкозу) добавляют к питательным средам(бульон, агар) в
стерильном виде в количестве 0,5–1%,стерилизуют фильтрованием или текучим паром.
Приготовление специальных питательных сред. Для культивирования отдельных видов микроорганизмов
сконструированы питательные среды, соответствующие их ростовым потребностям. Например, для
выращивания актиномицетов рекомендуют специальную питательную среду следующего состава: вода
дистиллированная — 1000 мл; натрия нитрат — 2,0 г; калия хлорид — 0,5 г; железа сулафат — 0,35; калия
сульфат — 0,35; сахароза — 30 г; агар-агар — 12 г.
Приготовление элективных питательных сред. Для культивирования каждого болезнетворного
микроорганизма, как правило, создано несколько вариантов элективных питательных сред.
Для выделения листерий из материала используют следующую плотную питательную среду. К
питательному агару (pH 7,3) как основе добавляют (г/л) эскулин — 1,0;цитрат железистого аммония — 0,5;
лития хлорид — 15,0;циклогексимид — 0,4; колистин — 0,02; акрифлавин —0,005; цефотетан — 0,002;
фосфомицин — 0,01. Большинство перечисленных добавок ингибируют рост сопутствую-щей микрофлоры, но
не действуют на листерии.
21

22. Приготовление дифференциально-диагностических питательных сред

Среды Гисса используют для выявления сахаролитических ферментов у чистых культур бактерий.
При их изготовлении к 100 мл дистиллированной воды добавляют 1% пептона, 0,5 г натрия хлорида,
0,1%индикатора Андреде (или другого индикатора). При изготовлении полужидкой среды вносят 0,2–0,4%
агар-агара. Смесь фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают путем добавления 10%-ного раствора
натрия гидроокиси pH на уровне 7,1–7,2 и стерилизуют 15 мин при 121⁰С. Затем в среду вносят необходимое
количество углевода(глюкозы, лактозы, маннита, сахарозы — по 1%; мальтозы, рамнозы, ксилозы — по
0,05%). При этом может происходить закисление среды, и pH корректируют добавлением по каплям натрия
гидроокиси до восстановления исходного цвета среды. Приготовленную среду Гисса разливают по пробиркам и
автоклавируют 30 мин при 110⁰С или дробно-текучим паром. Готовые среды с индикатором Андреде имеют
соломенно-желтый цвет, при закислении среда краснеет.
В настоящее время биопромышленность выпускает сухие среды Гисса с индикатором ВР (смесь водного
голубого с розовой кислотой), который при закислении меняет цветот розового в щелочной среде через серый
при нейтральном pH до голубого или ярко-синего в кислой среде.
22

23. Среды Эндо, Левина

Указанные дифференциально-диагностические питательные среды являются плотными, предназначены
для изоляции бактерий из материала и определения их способности расщеплять лактозу.
При изготовлении среды Эндо к 1000 мл расплавленного МПА (pH 7,4) при температуре 70С добавляют 1
глактозы, предварительно растворенной в небольшом количестве дистиллированной кипяченой воды. В
отдельных пробирках готовят: 2–3 мл спиртового раствора фуксина;10 мл водного раствора (10%) натрия
сульфита. В стерильную пробирку вносят 1 мл раствора фуксина и добавляют раствор натрия сульфита до
обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, компоненты перемешивают
и среду разливают по чашкам Петри. Готовая среда имеет розовый цвет, при росте на ней микроорганизмов,
расщепляющих лактозу, обесцвеченный фуксин восстанавливается, и колонии микроба приобретают красный
цвет.
В настоящее время выпускают сухую среду Эндо. Готовую среду получают путем растворения в 100 мл
дистиллированной воды 5 г сухой среды, смесь кипятят при постоянном перемешивании в течение 2–3 мин и
разливаютпо чашкам Петри .
Среда Левина аналогична по целевому назначению агару Эндо, но содержит другой индикатор (эозин с
метиленовым синим). При росте на ней лактозо позитивных бактерий колонии окрашиваются в фиолетовочерный цвет.
Существуют плотные дифференциально-диагностические среды, основанные на иных ферментативных
особенностях бактерий (агар с мочевиной, висмут-сульфитный агар), но в любом случае колонии
микроорганизмов приобретают при росте на подобных средах определенный цвет, в зависимости от субстрата
или индикатора.
23

24. Приготовление окрашенных препаратов.

Обработка предметных и покровных стекол.
Прежде чем приступить к приготовлению микроскопических препаратов, необходимо обработать
предметные и покровные стекла. Они должны быть чистыми и обезжиренными. Доказательством хорошего
обезжиривания предметных и покровных стекол является равномерное распределение капли воды на их
поверхности.
Стекла промывают водой, затем выдерживают в смеси спирт-эфира. После извлечения из спирт-эфира
стекла фламбируют над пламенем, чем и достигается их стерильность. Новые стекла можно готовить также
путем их кипячения в течение 10 мин в 1%-ном растворе соды, промывания в дистиллированной воде
(добавляя к ней 0,5%-ной соляной кислоты для нейтрализации) и окончательного ополаскивания в чистой
дистиллированной воде.
Стекла, бывшие в употреблении, выдерживают два часа в 20%-ном растворе серной кислоты, промывают
водой и кипятят в2%-ном растворе соды или мыльной воде. После ополаскивания в чистой воде их протирают
мягкой полотняной салфеткой.
Обработанные стекла xpaнят в банке с притертой пробкой сухими или в спирте, а также в спирт-эфирном
растворе
24

25. Приготовление мазка.

Мазок готовят на предметном стекле при помощи бактериологической петли или пастеровской пипетки из
культур микробов, тканей, крови, гноя и т. д. Бактериологическая петля представляет собой платиновую
проволочку, которую закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Платина обладает
большой теплопроводностью, она быстро нагревается и также быстро остывает. Эти свойства платины
создают большие удобства при работе с микробными культурами: сокращается время на охлаждение, тем
самым исключается возможность гибели живых культур. Используют также одноразовые стерильные петли в
двух объемах: 1 мкл и10 мкл.
Мазки готовят из культур микроорганизмов, выращенных на плотной или жидкой питательной среде.
Бактериологическую петлю нагревают до покраснения, над пламенем горелки открывают пробирку, внутрь
которой вводят петлю. После охлаждения петлей прикасаются к культуре, которую затем тонким слоем
распределяют на поверхности предметного стекла. При изготовлении мазков из плотного субстрата или
агаровых культур на поверхность стекла предварительно наносят каплю стерильного физиологического
раствора или воды.
Стерильными пастеровскими пипетками делают мазки из жидкостей и бульонных культур. Над пламенем
горелки отламывают запаянный конец пипетки и набирают матери-ал. После нанесения капли культуры на
предметное стекло и ее распределения пипетку опускают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Мазок
фиксируют при комнатной температуре.
25

26. Фиксация мазка.

Существует несколько методов фиксации мазка. Наиболее простой и распространенный среди них —
фиксация над пламенем горелки. Для этой цели предметное стекло с мазком берут большим и указательным
пальцами или пинцетом и проводят три-четыре раза над огнем, каждый раз при этом прикладывая стекло к
поверхности кожи руки. Ощущение тепла от стекла свидетельствует о том, что мазок зафиксирован. Этот
способ фиксации до-пустим при морфологическом исследовании клетки.
Для его выполнения используют химические фиксаторы.
Этиловый спирт (96%-ный) в течение 10–15 мин.
В отдельных случаях также применяют абсолютный спирт. Его готовят из 96%-ного спирта путем
обезвоживания свежепрокаленным медным купоросом. На 1 л спирта берут 150 г безводного медного купороса,
который прокаливают до полного растворения соли. Обезвоженный спирт хранят в стеклянной банке с
притертой пробкой, с небольшим количеством прокаленного медного купороса на дне.
При фиксации на мазок наносят несколько капель спирта, выдерживают 5 мин, затем его сливают. Смесь
разных объемов этилового спирта и серного эфира в течение 10–15 мин (до испарения).Ацетон (5
мин).Метиловый спирт (2–3 мин).Пары формалина. Влажные предметные стекла помещают на стеклянные
или другие палочки мазком вниз. При слабом подогревании формалина в чашке Петри образуются пары,
обладающие фиксирующими свойствами.
В результате химической фиксации мазок прикрепляется к стеклу, происходит обезвреживание микробов,
улучшаются тинкториальные свойства, поскольку мертвый белок воспринимает краситель лучше, чем живой.
26

27. Методы окрашивания.

Различают простые и сложные методы окрашивания. Простое окрашивание проводят быстро, вследствие
чего его применяют чаще. При этом методе используют всего один краситель, чаще всего это водный раствор
фуксина Пфейффера или метиленовой сини Леффлера.
Методика окрашивания: на фиксированный мазок с помощью пипетки наносят несколько капель
красителя. Время окрашивания водным раствором фуксина Пфейффера составляет 1–2 мин, метиленовой
сини — 2–3 мин.
Краситель смывают водой, мазок высушивают и фиксируют с использованием иммерсионной системы
микроскопа.
Палочковидные или цилиндрические микробы характеризуются вариабельностью по форме, длине и
толщине. Форма может быть овоидная, цилиндрическая, веретенообразная.
Палочковидные формы делят на две группы: образующие споры (бациллы) и не спорообразующие
(бактерии).
27

28. Характеристика красителей.

При окрашивании мазка краситель проникает в микробную клетку, это дает возможность оценить не
только еe внешние признаки —форму, размеры, наличие капсулы, жгутиков, — но и не-которые особенности
внутренней структуры. В микробиологической практике используют основные и кислотные красители.
Из основных красителей наиболее часто применяют: фуксин основной, сафранин, нейтральрот (красные
красители); метиленовую синь, азур II (синие красители); мала-хитовую зелень (зеленый краситель); везувин,
хризоидин(коричневые красители). Из кислотных используют фуксин кислый, эозин, эритрин, конго (красные
красители);пикриновую кислоту (желтый краситель); негроин (черный краситель).
Растворы красителей могут быть как спиртовые, так и водные. Спиртовые растворы являются более
устойчивыми, их готовят заранее. Для этого порошок красителя разводят спиртом (96%-ным) в соотношении
1:10. Насыщенные растворы хранят в банках с притертыми пробками. Водныерастворы красителей
отличаются медленным и нестойким окрашиванием. Для усиления действия красителя к нему добавляют
протравляющее вещество, которое повышает стойкость водно-спиртовых растворов, способствует разрыхлению оболочки микробной клетки и лучшему окрашиванию. К протравляющим веществам относят
спирт,формалин, карболовую кислоту, щелочи.
.
28

29.

В лабораторной практике наиболее часто применяют следующие растворы красителей:
Карболовый фуксин Циля. Смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина со 100
мл5%-ного раствора карболовой кислоты. Насыщенный раствор основного фуксина можно получить
смешиванием 8 г основного фуксина и 100 мл спирта.
Карболовый фуксин Пфейффера. Смешивают 1 мл фуксина Циля с 9 мл дистиллированной воды.
Метиленовая синь щелочная (Леффлера). К 30 мл10%-ного насыщенного спиртового раствора добавляют1
мл 1%-ного раствора KOH и 100 мл дистиллированной воды. Краситель в течение суток выдерживают,
фильтру-ют, после чего он готов к применению. Краситель отличается стойкостью и хорошими
тинкториальными свойствами.
Карболовый генцианвиолет. 1 г кристаллического ген-цианвиолета растворяют в 10 мл 96%-ного спирта.
К насыщенному раствору добавляют 100 мл 2%-ного водного раствора карболовой кислоты.
Сафранин. 2 г красителя растворяют в 100 мл смеси(спирт 96%-ный и дистиллированная вода поровну)
или100 мл кипящей дистиллированной воды, затем фильтру-ют. Используют при окрашивании бруцелл, а
также капсул возбудителя сибирской язвы.
Малахитовая зелень. 1 г красителя растворяют в100 мл дистиллированной воды, затем фильтруют.
Используют при окрашивании бруцелл.
Раствор Люголя. Этот раствор применяют при окра-шивании по Граму: 2 г йодистого калия растворяют в
25 мл дистиллированной воды. Затем к раствору добавляют 1 г кристаллического йода, объем доводят до 300
мл дистиллированной водой и фильтруют.
29

30.

Из извитых форм бактерий при исследовании биоматериала имеет значение выявление вибрионов и
спирохет (лептоспиры), а из числа патогенных простейших(Protozoa) — возбудителей трихомоноза и
трипаносомоза.
Вибрионы имеют форму запятой со жгутиком на конце. Поворот тела вокруг оси у них не превышает одной
четверти.
Спириллы характеризуются небольшим (не более пяти) количеством завитков. Передвигаются с помощью
жгутиков.
Спирохеты имеют штопорообразную форму и большое количество мелких завитков. Обладают
способностью сокращаться и осуществлять сгибательные, вращательные и поступательные движения.
Негативный метод окраски. Метод ориентирован на окрашивание фона, при этом микробы остаются
нативными. Окрашивание проводят кислотными красителями: конгоротом, колларголом, кармином.
Техника окрашивания. На предметное стекло наносят каплю 3%-ного раствора красителя конгорот, в эту
же каплю вносят исследуемый материал и слегка смешивают. Затем при помощи покровного стекла
постепенно под углом 45 делают мазок по принципу приготовления мазков крови. Мазок высушивают на
воздухе, не фиксируют и изучают с использованием иммерсионной системы микроскопа. На краснокоричневом фоне хорошо при этом визуализируются неокрашенные формы микробов.
30

31.

Метод Бурри. Выполняют аналогично предыдущему, но вместо водного раствора конгорот берут хорошо
отцентрифугированную тушь. При микрокопировании отчетливо видны бесцветные микробы на черном фоне.
Окрашивание спор. Споры окрашивают сложным методом, так как они имеют плотную оболочку. Перед
окрашиванием необходимо увеличить порозность оболочки спор, что достигается воздействием на нее
протравителями (хромовой, соляной кислотами) или раствором карболовой кислоты при подогревании.
Оболочка при этом размягчается, еe порозность возрастает. Краситель хорошо адсорбируется, споры не
обесцвечиваются при кратковременном воздействии кислотой. Микробные клетки обесцвечиваются при
таком воздействии и становятся видимыми только при дополнительном окрашивании контрастным
красителем.
Техника окрашивания по методу Златогорова. Мазок фиксируют над пламенем горелки. На его
поверхность размещают фильтровальную бумагу величиной с покровное стекло, окрашенную фуксином Циля.
Бумагу смачивают тремя-пятью каплями воды. Окрашивание проводят при подогревании в течение 4–5 мин.
Чтобы предупредить высыхание мазка, во время испарения жидкости по каплям добавляют воду.
Затем мазок обесцвечивают 3%-ным водным раствором серной кислоты в течение 3–5 мин. После этого его
промывают водой и высушивают.
В поле зрения микроскопа видны споры, окрашенные в красный цвет, и вегетативные клетки — в синий.
31

32.

Окрашивание спор по М. А. Пешкову является наи-более простым и демонстративным. После фиксации
над пламенем горелки или смесью спирта с формалином мазок окрашивают леффлеровской метиленовой
синью над пламенем в течение 15–20 секунд, затем промывают водой. Дополнительное окрашивание проводят
0,5%-ным водным раствором нейтральрота в течение 30 секунд, после этого промывают водой и высушивают.
Микроскопическая картина следующая: споры голубого или синего цвета, молодые споры — черно-синие,
вегетативные формы — розовые, включения (хроматиновые) —фиолетовые.
Окрашивание капсул. Некоторые микробы образуют капсулы — видоизмененные, ослизненные и
набухшие оболочки. Величина их различна, но чаще превышает тело микробной клетки. По химическому
составу капсулы представлены либо из комплекса белков, либо — белково углеводными комплексами. Капсула
и оболочка клетки окрашиваются неодинаково. Капсула, выполняющая роль защиты, часто окружает
патогенные микробы. Такие микробы инкапсулируются в организме животного (in vivo)и редко на
искусственных средах (in vitro). Капсулы слабо преломляют свет, поэтому в живой неокрашенной клетке их
обнаружить трудно. Существует несколько методов окрашивания капсул.
Метод Ольта. Мазок окрашивают 2–3%-ным раствором сафранина. Краситель готовят перед
употреблением, растворяя его в горячей воде с последующим фильтрованием. Окрашивание проводят при
легком нагревании в течение 1–3 мин и быстро промывают водой. Препарат не высушивают, на нем должна
сохраняться вода. Затем препарат накрывают покровным стеклом и изучают с помощью иммерсионной
системы микроскопа. Световые лучи, проходя через слои воды, усиливают различия в преломлении лучей от
капсулы и тела микробной клетки. В поле зрения микроскопа видно, что тела микробных клеток окрашены в
красный цвет, капсулы — в желтый.
32

33.

Этапы выделения чистой
культуры
Схема №7.
Источник [7].
33

34. Источники:

1. Методология научного исследования : учебник для вузов / Н. А. Слесаренко, Е. Н. Борхунова, С. М. Борунова [и др.]
; под редакцией Н. А. Слесаренко. — 5-е изд., стер. — Санкт-Петербург : Лань, 2021. — 268 с. — ISBN 978-5-8114-7204-8. —
Текст : электронный // Лань : электронно-библиотечная система. — URL: https://e.lanbook.com/book/156383
2. Госманов, Р. Г. Практикум по ветеринарной микробиологии и микологии : учебное пособие / Р. Г. Госманов, Н. М.
Колычев, А. А. Барсков. — Санкт-Петербург : Лань, 2022. — 384 с. — ISBN 978-5-8114-1625-7. — Текст : электронный //
Лань : электронно-библиотечная система. — URL: https://e.lanbook.com/book/211544
3. https://studfile.net/preview/8206356/page:28/
4. https://studfile.net/preview/399396/
5. https://studfile.net/preview/16537744/page:21/
6. https://kasheloff.ru/photos/vidiy-sred-mikrobiologiya/
7. Сбойчаков, В. Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований :
учебник / В. Б. Сбойчаков. — 2-е изд. — Санкт-Петербург : СпецЛит, 2011. — 608 с. — ISBN 978-5-299-00404-5. — Текст :
электронный // Лань : электронно-библиотечная система. — URL: https://e.lanbook.com/book/60071
34