Готовая презентация

1.

Разработка плазмидного калибровочного
стандарта для микроРНК
Шишпарёнок Александр Александрович

2.

Этапы создание ПЦР тест-системы для детекции микроРНК
Предпроектная фаза
Цель теста
Материал
Регуляторные требования
Клиническая валидация
Подбор когорты
Сравнение с референсным методом
(если есть) или консенсус-оценка
Статистические показатели
Оформление SOP
Документация, контроль качества и регуляторика
SOP на все ключевые операции
Журнал контроля качества реактивов/приборов
Валидационный отчёт
Маркировка, упаковка и инструкции для пользователя
План регулярной мониторной валидации и контроля
стабильности партий
Дизайн аналитической части
Анализ целевой микроРНК
Дизайн праймеров для обратной
транскрипции (stem-loop)
Биоинформатический анализ на офф-таргеты
(blast)
Определение формата (одноцелевой qPCR,
мультиплекс и т.д.)
Аналитическая валидация
Линейность и диапазон
Эффективность реакции
Предел обнаружения (LOD)
Лимит линейности / нижняя граница
количественного определения (LLOQ)
Специфичность
Повторяемость и воспроизводимость
Интерференция и матричные эффекты
Стабильность стандарта и образцов
Калибровка и контроль качества
Внедрение и поддержка
Тренинг персонала, проверки
межлабораторной совместимости
Внедрение процедур контроля качества
в рутинный рабочий процесс
Поддержка обновлений: пересмотр
праймеров/зондов при появлении
новых изоформ/вариантов miRNA
Подготовка контролей и стандартов
Синтетический стандарт miRNA
Экзогенный spike-in контроль
Плазмидный стандарт
Лабораторная сборка и первоначальная
проверка (концептуально)
Получение синтетических праймеров /
зондов / олигонуклеотидов
Первичный тест на модельных образцах
(синтетики) для проверки
Проверка специфичности на панеле
близкородственных miRNA

3.

Этапы синтеза плазмидного контроля
Дизайн плазмидного стандарта
Синтез вставки методом
сшивающей ПЦР (overlap-extension
PCR)
Клонирование вставки в плазмиду
Первичный скрининг колоний на
наличие вставки
Наращивание бактерий с
плазмидой прошедших
первичный скриниг
Выделение плазмидной ДНК с
целевой вставкой
Оценка качества плазмидной ДНК
путем определение концентрации
методом абсорбции при 260 нм
(например, Nanodrop) и проведением
электрофореза
"Подтверждающий" скрининг
очищенной плазмидной ДНК
методом ПЦР
Контроль рестрикцией или
линеаризация
Секвенирование плазмидной ДНК

4.

Получение целевой вставки методом обратной транскрипции и ПЦР
ДНК аналог hsa-miR-143-3
Праймер "стебель-петля"
"петля"
"стебель"
Обратная
транскриптаза
Денатурация при ПЦР
Расплетение праймера "стебель-петля" при денатурации

5.

Получение целевой вставки методом обратной транскрипции и ПЦР
Полимераза
Прямой праймер
Схематическое изображение синтеза второй цепи вставки
Целевая вставка в виде двухцепочечной ДНК

6.

Клонирование целевой вставки в плазмиду pJET 1.2
pJET 1.2

7.

Получение (наработка) плазмидной ДНК с целевой вставкой
Наработка плазмиды
в бактериальной культуре
Выделение и очистка плазмидной ДНК

8.

Проверка плазмидной ДНК на наличие целевой вставки и отсутствия геномной
ДНК
В условиях электрофореза
на 1,5% агарозном геле не
выявляется ДНК-фрагмент
размером > 20 кпн, что
свидетельствует об
отсутствии геномной ДНК.
На 3% агарозном геле
выявляется ДНК-фрагмент
прогнозируемого размера,
соответствующий
ампликону М13-области,
содержащему целевую
вставку

9.

Секвенирование области плазмиды, фланкирующей целевую вставку, с
использованием праймеров М13

10.

Проблемы получения целевой вставки методом обратной транскрипции и ПЦР
Процесс получения целевой вставки через обратную транскрипцию
сопровождается возникновением замен и делеций. В последнем
эксперименте делеции были выявлены у 5 из 6 изолированных клонов, а в
предыдущей серии — у всех клонов. На Sanger-хроматограмме эти
изменения проявляются следующим образом.

11.

Получение целевой вставки методом Overlap-PCR (альтернативный метод)
Отжиг
Over-lap PCR
Синтез цепи
Двойная цепь
Амплификация
Посадка праймеров
Увеличение
количества
ампликонов

12.

Получение целевой вставки методом обратной транскрипции
Отжиг синтетического
стандарта микроРНК
(ДНК/РНК)
Обратная
транскрипция
Достройка праймера
«Стебель-петля»
Денатурация
Продукт обратной
транскрипции