Методы исследования уровня экспрессии генов

1.

Методы исследования
уровня экспрессии генов
Васильев Геннадий Владимирович
Институт цитологии и генетики СО РАН

2.

Представленность различных мРНК
1%
Многокопийные
мРНК
«редкие» мРНК

3.

Нозерн-блот анализ (Nothern-blot)
Гибридизация с
радиоактивно
меченым
зондом
Разделение РНК в
денатурирующем
геле по размеру
Результат
авторадиографии
Перенос РНК на
нитроцеллюлозный
фильтр
Отмывка от
несвязавшегося
зонда

4.

Нозерн-блот анализ (Nothern-blot)
Преимущества метода
1.
2.
3.
Довольно точная оценка
экспрессии гена
Сравнительный анализ нескольких
образцов
Возможность оценить не только
наличие, но и размер транскрипта
(транскриптов)
Недостатки метода
1.
2.
3.
4.
Недостаточная чувствительность
метода
Необходимы довольно большие
количества суммарной РНК
Необходимость работать с
радиоактивными изотопами.
Редкие и слабо представленные
РНК не выявляются, что может
приводить к ложноотрицательному
результату.

5.

Методы на основе ПЦР
Качественные:
1. Дифференциальный дисплей
2. Неконкурентная мультиплексная ПЦР
Полуколичественные:
1. Конкурентная мультиплексная ПЦР
2. Анализ с помощью микрочипов
Количественный:
1. ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)
2. Цифровая ПЦР

6.

Реакция обратной транскрипции
3’
мРНК
поли A хвост
oligo dT праймер
Реакция обратной
транскрипции – синтез
кДНК по матрице мРНК
кДНК

7.

Полимеразная цепная реакция
Прямой
5’ праймер
обратный
праймер
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
5’
5’

8.

Полимеразная цепная реакция
Наработка специфического продукта.
Теоретицеский коэффициент размножения – 2
Реальный коэффициент размножения в хорошо
оптимизированных условиях– 1,6-1,4.

9.

Дифференциальный дисплей
Образцы
мРНК
синтез кДНК
ПЦР реакция с
использованием
комбинации
случайных
праймеров

10.

Дифференциальный дисплей
Преимущества метода
1.
2.
3.
4.
Проведение сравнительного анализа
Анализ экспрессии сразу большого количества
генов
Теоретически возможно идентифицировать все
неизвестные транскрипты
Низкая стоимость используемых реактивов
Недостатки метода
1.
2.
3.
Получение качественных, а не количественных
данных
Большая трудоёмкость метода
За счет конкуренции за dNTP и фермент не
выявляются “редкие” малокопийные мРНК

11.

Неконкурентная мультиплексная ПЦР
1
2
3
Фрагмент А
Контрольный
фрагмент
Интенсивность полосы А
Интенсивность контрольной
полосы
Неконкурентная мультиплексная ПЦР
является методом относительной оценки
экспрессии генов. Используют две пары
специфических праймеров в одной
реакции. В качестве контроля выступают
гены, экспрессия которых слабо
меняется в условиях эксперимента.

12.

Конкурентная мультиплексная ПЦР
Оба продукта ПЦР синтезируются с ОДНИХ и тех же праймеров.
Конкурентная ДНК добавляется в реакции серией
заранее известных разведений

13.

Особенности ПЦР, искажающие количественные показатели
•Существование фазы «плато»
•Уровень плато определяется множеством
параметров
•Высокая чувствительность метода
•Чувствительность ферментов к загрязнениям и
изменению условий
•Низкая чувствительность метода детекции
(окраска бромистым этидием).
Для фрагментов длиной менее 300 п.н.
детектируемые количества продукта
нарабатываются уже в районе перегиба, а не в
линейной фазе реакции
•Различия в эффективности амплификации
фрагментов разной длины и разного
нуклеотидного состава.
При разнице эффективности амплификации
двух фрагментов 5% изменение относительных
концентраций уже на 25 цикле составит 3,6 раза.
При 10% - 14 раз
При 15% - 58 раз.

14.

Мультиплексная ПЦР
Преимущества метода
Довольно точная оценка
экспрессии гена (возможно
обнаружить двукратные различия
при статистической обработке
результатов)
Метод достаточно дёшев, прост и
быстр.
Возможно оценить экспрессию
редких и слабо представленных
мРНК
Требуется малое количество
исходного материала
Недостатки метода
Главный недостаток – сильная
подверженность влиянию
«синдрома китайского студента».
Точность метода сильно зависит от
квалификации и подготовки
исследователя, что не является
объективным критерием.
На точности метода сильно
сказываются недостаточно
чувствительные методы детекции

15.

Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов.

16.

ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)
Детекция продукта производится в режиме
реального времени по флуоресценции
возбуждаемого лазером красителя
непосредственно в реакционной смеси.
Упрощённая модификация метода –
использование интеркалирующего
красителя SYBR-green.
Образование целевого продукта
отслеживается при построении кривой
плавления. Высокая чувствительность
метода позволяет гарантированно снимать
показания на линейной части кривой, до
выхода реакции на плато.

17.

Real-time PCR с использованием Taq-Man зондов.
Преимущества метода
1.
2.
3.
Точный метод оценки уровня экспрессии гена
Возможен сравнительный анализ экспрессии нескольких (до 4) генов в
одной пробе при использовании разных флуоресцентных красителей
Быстрота получения результата.
Недостатки метода
1.
2.
Сложности с выбором зондов
Высокие трудозатраты и цена

18.

Digital PCR.
Комбинация ПЦР в реальном времени с Taqman-зондами
и эмульсионной ПЦР с одной молекулы
Преимущества метода
Самый точный
Очень чувствительный
Недостатки метода
1.
2.
Сложности с выбором
зондов
Цена

19.

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов
Микрочипы – стеклянные пластинки с иммобилизоваными короткими фрагментами ДНК
Олигонуклеотидные
На основе участков кДНК

20.

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов

21.

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов

22.

Скрининг изменений экспрессии с помощью микрочипов
Преимущества метода
Быстрый скрининг по большому
количеству генов
Наличие уже готовых панелей с
различными целевыми наборами
зондов.
Возможность автоматизации
процедуры
Недостатки метода
Слабая воспроизводимость
Высокие уровни ошибок пере- и
недопредсказания
Результаты необходимо
перепроверять методом Real-time
PCR
Исследуются только заказанные
транскрипты

23.

SAGE - serial analysis of gene expression
Модификации метода – различаются по длине тага.
SAGE, LongSAGE, SuperSAGE
Синтез кДНК
Выделение фракции поли-А РНК
Разрезание первой рестриктазой
Лигирование с линкером, содержащим сайт
Eco15I
Рестрикция ферментом Eco15I
Лигирование с образованием ди-тагов
Отрезание линкеров третьей рестриктазой
Лигирование в конкатемеры
Клонирование в бактериальный вектор
Секвенирование методом Сэнгера
Секвенирование на пиросеквенаторе Roche

24.

SAGE - serial analysis of gene expression
Достоинства SAGE
Более точное количественное
измерение уровней транскрипции по
сравнению с микрочиповыми
технологиями
Возможность получения данных о
неизвестных до того транскриптах
Недостатки:
Меньшая точность по сравнению с
Real-Time PCR
Большая стоимость и трудоёмкость
по сравнению с микрочипами

25.

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования (RNA-Seq)
Добавление внутренних контролей ERCC mix
Получение фракции мРНК и ribo-depleted RNA
Фрагментация РНК РНКазой III
Лигирование со специфическими
адаптерами
Получение кДНК
Фракционирование
Амплификация библиотеки

26.

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования
Проведение ПЦР в эмульсии
Собственно секвенирование
Выравнивание и подсчёт копийности

27.

Single cell transcriptome

28.

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования
Метод, свободный от начальной гипотезы
Быстрый и сравнительно недорогой скрининг
транскриптома без предварительных его
исследований.
Возможность прямого сравнения экспрессии
интересующих групп генов.
Идентификация групп генов,
скоординированно меняющих свою
экспрессию.
Наглядная классификация транскриптов по
функциям и группам.
Обнаружение кластеров скоординированно
меняющих экспрессию генов, не связанных
общей функцией
Freed 2008

29.

Объёмы данных для различных вариантов RNA-Seq
1) Ribo-depletion – удаление рибосомальных РНК в ходе пробоподготовки.
Стандартный вариант – чтение с одного праймера, 50-75 п.н. – 40 млн. ридов.
Позволяет идентифицировать экспрессию 80-85% генов
При изучении альтернативного сплайсинга \ транскрипции – чтение с двух
сторон по 75\150 п.н.
2) Поли-А РНК - чтение с одного праймера, 50-75 п.н. – 20 млн. ридов.
3) Транскриптом de novo – максимально длинные чтения, поли-А РНК,
направленные библиотеки, 20-40 млн. ридов
4) Анализ микроРНК – 5-10 млн. ридов, чтение 36 п.н.
5) Single cell RNA-Seq – от 1 млн. ридов в стандартной методике до 100 тыс.
ридов в модификациях.

30.

Пределы достоверности
Неравномерность
распределения
чтений по гену
Внутренний контроль –
ERCC spike-In

31.

Прямое измерение уровня экспрессии с помощью методов
высокопроизводительного секвенирования
Относительная обеднённость/обогащённость определёнными последовательностями
в библиотеках
Неравномерность представленности фрагментов по длине транскрипта

32.

Панели РНК наборов генов как замена RT-PCR
50 ампликонов ~150 п.н. длиной для
количественной оценки экспрессии генов