Rekombinant Insulin Olish Texnologiyasi va E. Coli Orqali Ishlab Chiqarish

1.

Rekombinant Insulin Olish
Texnologiyasi va E. Coli Orqali
Ishlab Chiqarish

2.

Geterologik oqsil
sintezining asosiy
tamoyillari
Rekombinant insulin ishlab chiqarish zamonaviy
biotexnologiyaning eng katta yutuqlaridan biridir.
Ushbu jarayon inson insulin genini ajratib olish va
uni boshqa organizm hujayrasiga kiritishga
asoslangan. An’anaviy usullardan farqli olaroq
rekombinant texnologiya mahsulotning yuqori
darajada tozaligini va immunologik xavfsizligini
ta’minlaydi. E. coli bakteriyasi o’zining tez
ko’payishi
va
genetik
tuzilishi
yaxshi
o’rganilganligi sababli ushbu maqsadlar uchun
eng qulay mezbon hisoblanadi.

3.

Insulin gormonining
molekulyar tuzilishi
Inson insulini ellik bitta aminokislotadan tashkil topgan
murakkab oqsildir. U ikkita zanjirdan ya’ni yigirma bitta
aminokislotali A zanjir va o’ttizta aminokislotali B zanjirdan
iborat bo’ladi. Ushbu zanjirlar bir-biri bilan ikkita disulfid
ko’priklari orqali bog’langan bo’lib qo’shimcha ravishda A
zanjirning ichida bitta disulfid bog’i mavjud. Rekombinant
texnologiyada aynan ushbu ikki zanjirning to’g’ri bog’lanishini
ta’minlash eng muhim texnologik vazifa hisoblanadi.

4.

Genetik muhandislik
bosqichlarining boshlanishi
Jarayon inson insulin genini kodlovchi DNK ketma-ketligini
olishdan boshlanadi. Hozirgi kunda olimlar kimyoviy sintez
usuli bilan A va B zanjirlar uchun alohida genlarni
tayyorlaydilar. Ushbu genlar maxsus promotorlar va selektiv
markerlarni o’z ichiga olgan plazmid vektorlariga
joylashtiriladi. Keyingi bosqichda ushbu rekombinant DNK
molekulalari kompetent Escherichia coli hujayralariga
transformatsiya usuli yordamida kiritiladi va seleksiya
qilinadi.

5.

Vektor turlari va tanlash
mezonlari
Vektor sifatida odatda yuqori nusxali pBR322 yoki pUC
seriyasidagi plazmidlardan keng foydalaniladi.
Vektor tarkibida antibiotiklarga chidamlilik geni bo’lishi
rekombinant shtammlarni ajratib olish imkonini beradi.

6.

E. Coli mikroorganizmning
afzalliklari
Bakteriya yigirma daqiqa ichida bo’linadi va bu juda qisqa
vaqtda katta biomassa olishga yordam beradi.
Tizimning metabolizmi to’liq o’rganilgani sababli
ifodalanishini boshqarish ancha oson kechadi.
gen

7.

Genni ekspressiya qilish
strategiyasi
Insulin zanjirlari bakteriya ichida erkin holatda sintezlansa
ular proteolitik fermentlar ta’sirida tezda parchalanib ketishi
mumkin. Shuning uchun ko’p hollarda insulin genlari beta
galaktozidaza yoki boshqa barqaror oqsillar genlari bilan
birga gibrid holda sintezlanadi. Bunday qo’shma oqsillar
bakteriya hujayrasining ichida inklyuzion tanachalar shaklida
to’planadi va hujayra uchun toksik ta’sir ko’rsatmasdan
barqaror saqlanib qoladi.

8.

Bioreaktorda
kultivatsiya qilish
jarayoni
Transformatsiyalangan E. coli hujayralari nazorat qilinadigan
sharoitda bioreaktorlarda o’stiriladi. Bu jarayonda harorat, pH
darajasi va erigan kislorod miqdori qat’iy belgilangan
me’yorda ushlab turilishi lozim. Bakteriyalar kerakli zichlikka
yetganda IPTG kabi induktorlar qo’shiladi va rekombinant
oqsil sintezi faollashtiriladi. Maqsadli oqsilning maksimal
hosildorligini ta’minlash uchun odatda o’n ikki soatdan
yigirma to’rt soatgacha vaqt talab etiladi.

9.

Hujayralarni parchalash
texnikasi
Biomassani yig’ib olgandan so’ng hujayra devori mexanik
yoki ultratovush usullari bilan buziladi.
Ajralgan inklyuzion tanachalar sentrifugatsiya yordamida
qolgan hujayra qoldiqlaridan ehtiyotkorlik bilan tozalanadi.

10.

Inklyuzion tanachalarni eritish
va denaturatsiya
Tozalangan inklyuzion tanachalar tarkibidagi oqsillar noto’g’ri
buklangan holatda bo’ladi. Ularni eritish uchun kuchli
denaturatsiya qiluvchi moddalar ya’ni mochevina yoki
guanidin xlorid eritmalari ishlatiladi. Bu jarayon oqsil
zanjirlarini yoyish va ularni keyingi kimyoviy ishlovga
tayyorlash uchun zarurdir. Shundan so’ng insulin zanjiri
o’zining tashuvchi oqsilidan bromtsian yoki maxsus proteaza
fermentlari yordamida ajratib olinadi.

11.

Oqsilni qayta buklash
va renaturatsiya
Ajratib olingan A va B zanjirlari aralashtiriladi
va maxsus sharoitda oksidlanish-qaytarilish
reaksiyalari amalga oshiriladi. Maqsad zanjirlar
o’rtasida to’g’ri disulfid bog’larini hosil qilishdir.
Bu bosqich ko’pincha renaturatsiya deb ataladi
va oqsilning biologik faolligini tiklaydi. Jarayon
samaradorligini oshirish uchun pH muhiti va
metall
ionlarining
konsentratsiyasi
laboratoriya sharoitida juda aniq nazorat
qilinishi shart.

12.

Xromatografik tozalash usullari
Ion almashinadigan xromatografiya oqsilni zaryadiga ko’ra
boshqa aralashmalardan samarali ajratadi.
Yuqori
samarali
suyuqlik
xromatografiyasi
yakuniy
mahsulotning 99 foizdan yuqori tozaligini ta’minlaydi.

13.

Proinsulin orqali ishlab
chiqarish usuli
Yana bir keng tarqalgan usul bu proinsulinni sintez qilishdir.
Bunda A va B zanjirlari C peptid orqali bog’langan bitta uzun
zanjir sifatida ifodalanadi. Proinsulin E. coli ichida
sintezlangandan so’ng in vitro sharoitida fermentativ ishlov
beriladi. Tripsinga o’xshash fermentlar C peptidni qirqib
tashlaydi va natijada tayyor insulin molekulasi hosil bo’ladi.
Bu usul zanjirlarni alohida sintez qilishga qaraganda ko’proq
hosildorlikni ta’minlashi mumkin.

14.

Sifat nazorati va
standartlashtirish
Tayyor mahsulotning aminokislotalar ketma-ketligi inson
tabiiy insulini bilan bir xilligi tekshiriladi.
Bakterial endotoksinlar mavjudligi bo’yicha qat’iy testlar
o’tkaziladi va xavfsizlik sertifikati beriladi.

15.

Liofilizatsiya va
tayyor dori shakli
Tozalangan insulin eritmasi barqarorlikni ta’minlash uchun
liofil quritish jarayonidan o’tkaziladi. Bu mahsulotni past
haroratda vakuum ostida muzlatib quritish demakdir.
Natijada kukunsimon insulin olinadi va u uzoq muddat
saqlanish xususiyatiga ega bo’ladi. Keyinchalik ushbu kukun
steril erituvchilar va konservantlar bilan aralashtirilib
inyeksiya uchun tayyor flakonlar yoki kartrijlar holatiga
keltiriladi va tibbiyot amaliyotiga yuboriladi.

16.

Texnologiyaning ekologik va
iqtisodiy samarasi
Ilgari bir kilogramm insulin olish uchun o’n tonnadan ortiq
hayvon oshqozon osti bezi talab etilar edi. Rekombinant
texnologiya esa bir necha ming litrli bioreaktorda xuddi
shuncha mahsulotni qisqa muddatda olish imkonini beradi.
Bu nafaqat tannarxni pasaytiradi balki hayvonlardan o’tishi
mumkin bo’lgan virusli kasalliklar xavfini ham butunlay yo’q
qiladi. Shuningdek ushbu texnologiya barqaror va uzluksiz
ishlab chiqarishni kafolatlaydi.

17.

Zamonaviy insulin analoglari
Genetik muhandislik yordamida tezkor ta’sir etuvchi Lispro
yoki Aspart kabi insulin analoglari yaratilgan.
Uzoq muddatli ta’sirga ega Glargin kabi analoglar qandli
diabetni davolashda katta qulaylik yaratadi.

18.

Ishlab chiqarishdagi
muammolar va yechimlar
E. coli tizimida oqsilning glikozillanishi kabi
post-translatsion o’zgarishlar sodir bo’lmaydi.
Bu insulin uchun muammo bo’lmasa-da
boshqa murakkab oqsillar uchun kamchilik
hisoblanishi mumkin. Shuningdek bakterial
endotoksinlarni
to’liq
ketkazish
yuqori
texnologik va qimmat jarayon hisoblanadi.
Bugungi kunda ushbu muammolar ustida
tadqiqotlar davom etmoqda va yanada
takomillashgan ekspressiya tizimlari ustida ish
olib borilmoqda.

19.

Kelajakdagi istiqbolli
yo’nalishlar
Genetik modifikatsiyalangan o’simliklar va sut emizuvchilar
hujayrasida insulin olish sinovdan o’tkazilmoqda.
Og’iz orqali qabul qilinadigan insulin kapsulalarini yaratish
biotexnologiyaning yangi bosqichi bo’ladi.

20.

Xulosa va yakuniy fikrlar
Rekombinant insulin texnologiyasi insoniyat hayotini saqlab
qolishda inqilobiy qadam bo’ldi. E. coli bakteriyasi yordamida
oqsillarni sanoat miqyosida ishlab chiqarish fanning amaliyot
bilan uzviy bog’liqligini ko’rsatadi. Kelajakda genetik
muhandislik usullari yanada arzonlashishi va takomillashishi
natijasida butun dunyoda diabetga qarshi dori vositalarining
ochiqligi yanada ortadi. Ushbu texnologiya zamonaviy
biofarmatsevtikaning asosi bo’lib xizmat qilmoqda.