АЛГОРИТМ РАБОТЫ (анализ последовательности)

Форматы файлов, используемых в биоинформатике

Дополнительный анализ последовательности

Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

Сайты в последовательности целевого гена

5.66M

Categories:

medicine

biology

software

Генетическая инженерия

1. Генетическая инженерия

2. АЛГОРИТМ РАБОТЫ (анализ последовательности)

• Провести BLAST целевой последовательности
• Определить гомологов
• Определить потенциальную функцию белка
• Дать статистическую оценку найденным гомологам

3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

7. Форматы файлов, используемых в биоинформатике

FASTA
>roa1_drome Rea guano receptor type III >> 0.1
MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDV
VVMKDPRTKRSRGFGFITYSHSSMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVK
KLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHFGNIVDNIVIDKETGKKRGFAFVEFDDYDPVDKVVLQK
QHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNW
NNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGG
GGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGN
NQGFNNGGNNRRY
>roa2_drome Rea guano ligand
MVNSNQNQNGNSNGHDDDFPQDSITEPEHMRKLFIGGLDYRTTDENLKAHEKWGNIVDV
VVMKDPTSTSTSTSTSTSTSTSTMIDEAQKSRPHKIDGRVEPKRAVPRQDIDSPNAGATVK
KLFVGALKDDHDEQSIRDYFQHLLLLLLLDLLLLDLLLLDLLLFVEFDDYDPVDKVVLQK
QHQLNGKMVDVKKALPKNDQQGGGGGRGGPGGRAGGNRGNMGGGNYGNQNGGGNW
NNGGNNWGNNRGNDNWGNNSFGGGGGGGGGYGGGNNSWGNNNPWDNGNGGGNFGG
GGNNWNGGNDFGGYQQNYGGGPQRGGGNFNNNRMQPYQGGGGFKAGGGNQGNYGN
NQGFNNGGNNRRY

8.

9.

Step 3: choose the database
nr = non-redundant (most general database)
dbest = database of expressed sequence tags
dbsts = database of sequence tag sites
gss = genomic survey sequences
protein databases
nucleotide databases

10.

Step 4a: Select optional search parameters
organism
Entrez!
algorithm
page 107

11.

Этап 4a: Изменения необязательных параметров
Максимальное кол-во
выравниваний в выдаче
Вероятность нахождения
последовательностей с таким же
скором по случайным причинам
Scoring matrix

12.

Этап 4a: Изменения необязательных параметров
Автоматическая подстройка
под параметров под
короткие
последовательности
Для белка стандартно - 3, можно
установить 2 для короткого белка, или
4-5 для более точного поиска
Автоматическая подстройка под
контекстные особенности
организмов (GC состав)

13. АЛГОРИТМ РАБОТЫ (анализ последовательности)

• Поиск в базах данных всей известной информации:
• http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi

14.

15. 16. Дополнительный анализ последовательности

• http://www.bioinformatics.org/sms2/

17. 18. Анализ белкового продукта гена

19. АЛГОРИТМ РАБОТЫ

НАЙТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ САЙТОВ В
ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА.
ПРОВЕСТИ ПОИСК ЭТИХ САЙТОВ В
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА.
ВЫБРАТЬ САЙТЫ В ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА ДЛЯ
КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОГО ГЕНА(ВЫБИРАЮТ ТЕ,
КОТОРЫХ НЕТ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦЕЛЕВОГО
ГЕНА). Учитывать направление промотора!!!
ПОДОБРАТЬ ПРАЙМЕРЫ К ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ЦЕЛЕВОГО ГЕНА (ПРЯМОЙ И ОБРАТНЫЙ).
ВВЕСТИ В СОСТАВ ПРАЙМЕРОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ВЫБРАННЫХ САЙТОВ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ.
СОСТАВИТЬ СХЕМУ КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОЙ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ВЕКТОР.

20. Вектора – что нужно учитывать

21. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

22. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

23. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

24. Где промотор – начало гена должно быть ориентировано к концу промотора

25. Область полилинкера –

26. Область полилинкера

27. Область полилинкера

28. Область полилинкера

29. 1 этап

1.
НАЙТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ САЙТОВ В
ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА. Bioinformatics.org/SMS/

30. Область полилинкера вектора

Уникальные сайты
(в области полилинкера):
BamHI – GGA TCC
SphI – GCA TGC
SacI – GAG CTC
KpnI – GGT ACC
SmaI – CCC GGG
XmaI – CCC GGG
SalI – GTC GAC
PstI - CTG CAG
HindIII – AAG CTT

31. АЛГОРИТМ РАБОТЫ

• ПРОВЕСТИ ПОИСК ЭТИХ
САЙТОВ В
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ЦЕЛЕВОГО ГЕНА.
Bioinformatics.org/SMS/

32. Последовательность целевого гена

• Atgactgccacgattcccccgttgacaccaacggtaacgcccagcaatcccgatcgcccga
ttgcggatctcaaactacaagacatcattaaaaccctgcccaaggaatgcttcgagaaaaaa
gcgagcaaagcctgggcttctgttttgattaccctaggggcgatcgccgtgggctatttgggcat
tatttatctgccctggtactgcttgcccattacctggatctggacagggacagccttaacggggg
ccttcgttgtcggccatgactgtggccatcgctcctttgctaaaaaacgctgggtcaatgatttag
tgggacatatcgcttttgctcccctcatctaccctttccatagctggcgcctactccacgaccacc
atcacctccacaccaacaaaattgaggttgataacgcctgggatccctggagtgtggaagctt
tccaagccagcccggcgatcgtccggcttttttatcgggccatccggggtcccttctggtggact
ggttccattttccattggagcttaatgcacttcaaactttccaactttgcccaaagggaccgcaat
aaagtcaaattatccattgccgttgtcttcctgtttgcggcgatcgcctttcctgccctaattatcac
cacaggggtgtggggtttcgtcaaattttggctaatgccctggttggtgtatcacttttggatgagc
acttttaccattgtgcaccacaccattcccgaaattcgtttccgtcccgccgccgattggagtgcc
gccgaagcccagttaaatggtactgttcactgcgattatccccgttgggtggaagtgctctgcc
atgacatcaacgtccatattccccaccacctctccgttgccatcccttcctataacctacgacta
gcccacggaagtttaaaagaaaactggggaccttttctttacgagcgcacctttaactggcaat
taatgcaacaaattagtgggcaatgtcatttatatgaccccgaacatggctaccgcaccttcgg
ctccctgaaaaaagtttaa

33. Сайты в последовательности целевого гена

34. Анализ сайтов рестрикции

35. 36. Сайты в последовательности целевого гена

37. АЛГОРИТМ РАБОТЫ

• ВЫБРАТЬ САЙТЫ В
ПОЛИЛИНКЕРЕ ВЕКТОРА ДЛЯ
КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОГО
ГЕНА(ВЫБИРАЮТ ТЕ, КОТОРЫХ
НЕТ В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ЦЕЛЕВОГО ГЕНА).

38. Область полилинкера вектора

39. АЛГОРИТМ РАБОТЫ

• ПОДОБРАТЬ ПРАЙМЕРЫ К
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ЦЕЛЕВОГО ГЕНА (ПРЯМОЙ И
ОБРАТНЫЙ).
Bioinformatics.org/SMS/

40. Последовательность целевого гена

41. Подбор праймеров

5’- Atgactgccacgattcc…………----………………………………………………
……cgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa – 3’
Прямой праймер – такой же как
последовательность в 5’ области
целевого гена.
Почему?

42. Подбор праймеров

5’- Atg act gcc acg att cc…………----3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер – «садится» на комплементарную цепь (3’ –
5’), следовательно, его последовательность совпадает. В
нашем случае: 5’- atg
act gcc acg att cc – 3’

43. Подбор праймеров

5’- Atgactgccacgattcc…………----………………………………………………
……cgcaccttcggctccctgaaaaaagtttaa – 3’
Обратный праймер – пишется с учетом
правила комплементарности.
Почему?

44. Подбор праймеров

5’- Atg act gcc acg att cc…………----3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Обратный праймер – «садится» на первую цепь (3’ – 5’),
следовательно, его последовательность должна быть ей
комплементарна. В нашем случае – 3’- gag gga ctt ttt tca
aat t – 5’
При заказе на синтез – праймер «переворачивают и пишут
следующим образом: 5’- t taa act ttt ttc agg gag - 3’

45. Прямое клонирование

• Сайты рестрикции можно ввести в 5’область праймера
• Провести ПЦР
• Сделать гидролиз ПЦР-продукта и
вектора соответствующими
эндонуклеазами рестрикции
• Провести лигирование целевого
фрагмента и вектора

46. АЛГОРИТМ РАБОТЫ

• ВВЕСТИ В СОСТАВ ПРАЙМЕРОВ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ВЫБРАННЫХ САЙТОВ ДЛЯ
КЛОНИРОВАНИЯ.
• Были выбраны сайты для SphI –
GCA TGC и SmaI – CCC GGG

47. Область полилинкера вектора

48. Введение сайтов рестрикции в праймеры

5’- Atg act gcc acg att cc…………----3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg
– 3’
act gcc acg att cc
SphI – GCA TGC
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t
gag - 3’
SmaI – CCC GGG
taa act ttt ttc agg

49. Расчет температуры отжига праймеров

(A+T)*2+(C+G)*4 (для праймеров до 20-25 п.н.)
Для праймеров большей длины более сложное:
22+1,46(2*(G+C) +(A+T))
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg act gcc acg att cc
– 3’
(14)*2+(15)*4= 88 градусов
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t
gag - 3’
(16)*2+(14)*4= 88 градусов
taa act ttt ttc agg

50. Прямое клонирование

• Две пары праймеров:
• Одна пара строго на
последовательность целевого гена
Прямой праймер: 5’- atg
att ccg att– 3’
(11)*2+(10)*4= 62 градуса
act gcc acg
Обратный праймер: 5’- t
agg gag ggc - 3’
(13)*2+(9)*4= 62 градуса
taa act ttt ttc

51. Прямое клонирование

• Провести ПЦР с первой парой
• Подобрать вторую пару праймеров с
введенными сайтами рестрикции
(уменьшая число нуклеотидов,
соответствующих целевой
последовательности для оптимизации
температуры отжига)

52. Прямое клонирование

• Провести ПЦР, используя ПЦР-продукт
первой реакции в качестве матрицы
• Сделать гидролиз второго ПЦРпродукта и вектора соответствующими
эндонуклеазами рестрикции
• Провести лигирование целевого
фрагмента и вектора

53. Прямое клонирование

• Через Т-вектор (в случае использования
Taq-полимеразы)
• Тогда сайты рестрикции можно ввести в
5’-концевую часть праймера без
добавления нуклеотидов

54. Введение сайтов рестрикции в праймеры

5’- Atg act gcc acg att cc…………----3’ Tac tga cgg tgc taa gg (комплементарная цепь)
……………………………………………………
ctt cgg ctc cct gaa aaa agt tta a – 3’
gaa gcc gag gga ctt ttt tca aat t – 5’
Прямой праймер: 5’- atc gat gca tgc atg
– 3’
act gcc acg att cc
SphI – GCA TGC
Обратный праймер: 5’- aca ttc ccc ggg t
gag - 3’
SmaI – CCC GGG
taa act ttt ttc agg

55. АЛГОРИТМ РАБОТЫ

• СОСТАВИТЬ СХЕМУ
КЛОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЕВОЙ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В
ВЕКТОР.

56.

Схема клонирования целевого гена в вектор.
Вектор
1. Гидролизуем вектор SphI и SmaI.
2. Проводим разделение
в агарозном геле.
3. ДНК выделяем из геля и
4. Используем для лигирования с
последовательностью целевого гена.
Целевая последовательность
1. Проводим ПЦР с подобранными
праймерами.
2. Клонируем (ПЦР-продукт в Т-вектор).
3. Гидролизуем Т-вектор со вставкой
целевого гена SphI и SmaI.
4. Проводим разделение
в агарозном геле.
5. Фрагмент ДНК соответствующего
размера выделяем из геля и
6. Используем для лигирования в
экспрессионный вектор.

57. Т-вектор

English Русский Rules