Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

1. Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

Московский государственный университет
им. М.В.Ломоносова
Химический факультет
Кафедра аналитической химии
Лаборатория биоаналитических методов анализа и оптических сенсорных систем
Видинчук Татьяна
Анатольевна
Студентка 6 курса
Руководитель
д.х.н., в.н.с. Беклемишев М.К.
Москва · 2023

2. Литературные данные

• Хлорофилл – зелёный пигмент растений, доступный длинноволновый
флуорофор (λem=680 нм)
• Немодифицированный хлорофилл как флуориметрический реагент
предложено использовать С.А.Захаренковой и др. в 2021 г.*
• Визуализация доставки гидрофильных соединений с использованием
карбоцианиновых флуорофоров предложена ею же. **
• Не все карбоцианины коммерчески доступны.
• Карбоцианины обладают собственной токсичностью.
• Хлорофилл как флуорофор для визуализации доставки лекарственных
веществ не изучен.
* Zakharenkova S.A. e.a. ACS Sustain. Chem. Eng. 2021, 9, 3408.
** Zakharenkova S.A. e.a. Molecules, 2021, 26, 7426.
2

3. Цель работы:

Использование хлорофилла как флуорофора для определения
лекарственных веществ и визуализации их доставки в
эукариотические клетки
Задачи:
• Показать возможность флуориметрического определения
цефтриаксона, блеомицина, винорелбина, метотрексата и
бензилпенициллина в воде и искуственной моче в виде тройных
агрегатов аналит-краситель-противоион.
• Выбрать системы для визуализации доставки этих соединений с
использований хитозанов и плюроников.
3
3

4. Методика. Схема визуализатора

Схема устройства регистрации флуоресценции в БИК-диапазоне:
1 – фотокамера, оснащенная светофильтром, пропускающим излучение с длиной волны более 700 нм,
2 – одиннадцать последовательно закрепленных красных светодиодов с максимумом излучения 660
нм,
3 – алюминиевый радиатор для охлаждения светодиодов,
4 – 96-луночный планшет с образцами,
5 – светонепроницаемый кожух
5

5. Выделение хлорофилла из шпината

• Экстракция смесью ацетона и гексана (1:1 об.)
• Удаление экстрагента испарением
• Растворение полученного остатка в ацетоне
• Разделение смеси на фракции методом ТСХ
• Десорбция ацетоном
5

6. Спектры поглощения и флуоресценции выделенных фракций

Спектр поглощения хлорофилла
Спектр флуоресценции хлорофилла
Выделенные фракции поглощают в различных областях спектра. Благодаря этому нам
удалось установить фракции хлорофилла «а» и «b».
Хлорофилл а активно флуоресцирует, в то времы как хлорофилл b не даёт сигнала.
6

7. Выбор условий определения цефтриаксона

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с цефтриаксоном
от концентраций компонентов
Условия определения
цефтриаксона и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 30-40 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (1 г/л) 60 мкл;
• ЦТАБ (0,01 м) 10 мкл;
• цефтриаксон (0,005 М в воде)
100 мкл.
а) ПГМГ', б) цефтриаксона, в) ЦТАБ г) времени
'ПГМГ - Полигексаметиленгуанидин
7

8. Выбор условий определения бензилпенициллина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с
бензилпенициллина от концентраций компонентов
Условия определения
бензилпенициллина и получения
тройных агрегатов для контейнеров
на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 10-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• бензилпенициллин (0,005 М) 150 мкл.
а) природы ПАВ б) бензилпенициллина
8

9. Сочетание хлорофилл-ПГМГ-ДДС

Зависомость от времени системы хдорофилл-ПГМГ-ДДС
Флуоресценция тройного агрегата с блеомицином малостабильна, флуоресценция контроля
и тройного агрегата с блеомицином сразу после приготовления отличается почти вдвое,
однако в течение 10 минут практически исчезает.
9

10. Выбор условий определения блеомицина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с цефтриаксоном от концентраций компонентов
Условия определения
блеомицина и получения
тройных агрегатов для контейнеров
на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 10 мкл;
• буфер бура (рН=8,5/9,2) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (1 г/л) 20 мкл;
• ДДС (0,008 м) 10 мкл;
• блеомицин (0,005 М в воде) 10
мкл.
а) рН б) ПГМГ в) ДДС' г) блеомицина д) метанола
‘ДДС – додецилсульфат натрия
10

11. Выбор условий определения винорелбина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с винорелбином от концентраций компонентов
Условия определения
винорелбина и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 15 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 м) 10 мкл;
• винорелбин (0,0093 М в
воде) 10 мкл.
а) ПГМГ б) ЦТАБ' в)винорелбина г) винорелбина и времени
'Цетилтриметиламмония бромид
11

12. Возможность образования тройных агрегатов с одноимённо заряженными ПАВ

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с винорелбином от природы ПАВ
Винорелбин способен образовывать тройные агрегаты как с катионными, так и с анионным
ПАВ (ЦТАБ и ДДС). Добавление ПГМГ в качестве коиона улучшает разницу
контроль/неконтроль.
12

13. Выбор условий определения метотрексата

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с метотрексатом от концентраций компонентов
а) природы ПАВ б) ПГМГ в) ЦТАБ г) метотрексата
13
Условия определения
метотрексата и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб в 10 раз)
15-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (1 г/л) 20-40 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• метотрексат (0,005 М) 100
мкл.

14. Определение в водном растворе

Зависимость флуоресценции тройного агрегата от концентраций аналита:
а) блеомицина б) винорелбина в) метотрексата г) бензилпенициллина
а)
б)
в)
г)
14

15. Определение в моче

Зависимость флуоресценции тройного агрегата от концентраций
аналита: а) метотрексата б) бензилпенициллина
а)
б)
15

16. Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами и противоионом и показана возможность их использования для

Характеристики методик определения лекарственных веществ
в воде и искусственной моче
Аналит
блеомицин
Предел
Общее число
Линейный
Предел
Общее число
Линейный
обнаружения
точек при
диапазон
обнаружения в
точек при
диапазон
в воде, М
определении
при
моче, М
определении
при
в воде
определен
в моче
определен
1,1Е-04
12
ии в воде,
ии в моче,
М
М
От 1,1Е-04
-
-
-
-
-
-
7,6Е-04
14
От 7,6Е-04
до 1,7Е-04
винорелбин
3,4Е-04
20
От 3,4Е-04
до 6,5Е-04
метотрексат
1,4Е-04
12
От 1,4Е-04
до 5,0Е-04
пензилпенициллин
4,5Е-05
15
От 4,0Е-05
до 2,7Е-04
16
до 2,7Е-04
1,0Е-03
22
От 1,0Е-03
до 1,2Е-03

17. Эффект ко-иона в системе хлорофилл-ПГМГ-ДДС-блеомицин

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с блеомицином от концентрации ПГМГ
ПГМГ является коионом по отношению к блеомицину, без ПГМГ тройные агрегаты
хлорофилл-ПАВ-блео флуоресцируют на уровне контрольного опыта (без блеомицина).
Флуоресценция возрастает в диапазоне концентраций ПГМГ (1 г/л) от 0 до 20 мкл.
Эффект коиона наблюдается только с блеомицином.
17

18. Контейнеры с цефтриаксоном и метотрексатом для визуализации доставки

Зависимость флуоресценции от природы полимера контейнеров с а) цефтриаксоном б) метотрексатом
а)
б)
Для контейнеров с цефтриаксоном в качестве полимеров выбраны немодифицированный,
карбоксиметилированный и малеинированный хитозаны.
Полученные системы содержат частицы размером 10-1000 нм и дзета-потенциалами около 0 мВ.
Для контейнеров с метотрексатом в качестве полимеров выбраны плюроники F-68 и F-127.
18

19. Контейнеры с винорелбином для визуализации доставки

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином а) от природы полимера
б) природы полимера и осаждения
а)
б)
Для контейнеров с винорелбином в качестве полимеров выбраны плюроники F-68 и F-127,
несульфатированный и сульфатированный малениированные хитозанами.
Причём только контейнеры с карб. хит. сохраняют флуоресценцию после осаждения.
Без осаждения другие полимеры дали слабо флуоресцирующий осадок, дающий сигнал на
уровне контрольного опыта.
19

20. Выбор полимеров для контейнеров

Аналит
Полимер
Цефтриаксон
Немодифицированный хитозан
Карбоксиметилированный хитозан
Малениированный хитозан
Метотрексат
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Винорелбин
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Малениированный хитозан несульф.
Малениированный хитозан сульф.
20

21. Ковалентная сшивка контейнеров с винорелбином эпихлоргидрином

Зависимость флуоресценции контейнеров
с винорелбином от природы хитозана
В сшитых эпихлоридом контейнерах с винорелбином и
хитозанами нет разницы контроль/неконтроль.
21

22. Стабильность флуоресценции тройных агрегатов и контейнеров с цефтриаксоном

Зависимость флуоресценции контейнеров от природы хитозана и времени
Сокращения:
хит. – хитозан;
немод. –
немодифицированный;
карб. –
карбоксиметилированный;
мал. –
малеинированный
.
Изменение сигнала (отн. контроля) со временем (в течение 2 сут.):
- тройные агрегаты (без полимера): уменьшается,
- несшитые контейнеры с немод. хитозаном: сохраняется,
- сшитые контейнеры с немод. хитозаном – возрастает (выталкивание цефтриаксона
сшивателем из агрегатов)
а в выводе у нас вообще-то карб и мал и плюроники
22

23. Стабильность флуоресценции тройных агрегатов с винорелбином

Зависимость флуоресценции контейнеров от природы ПАВ и времени
• Флуоресценция сохраняется в течение двух суток, если в качестве ПАВ
использованы ПГМГ+ДДС или лаурат в ацетоне
• В случае лаурата в воде разница с контрольным опытом появляется через сутки.
23
Что-то выбрали?

24. Стабильность флуоресценции в несшитых контейнерах с винорелбином

Зависимость флуоресценции контейнеров от природы ПАВ, хитозана и времени
• Возможна замена токсичного ДДС на лаурат (в случае тройного агрегата с винорелбином
и контейнеров с винорелбином и карбоксиметилированным, малеинированным
сульфатированным хитозанами, плюроником F-68).
• В системах с лауратом флуореценция через сутки возрастает.
Что-то выбрали?
24

25.

Что это
25

26. Устойчивость несшитых контейнеров к диализу

Состав контейнера
Аналит
полимер
ПАВ
Время диализа до разрушения
контейнера
Плюроник F-68
Лаурат в ДМСО
1ч
Плюроник F-127
Лаурат в ДМСО
1ч
Карб. хит.
ЦТАБ-ПГМГ
45 мин
Плюроник F-68
ЦТАБ-ПГМГ
10 мин
Плюроник F-127
ЦТАБ-ПГМГ
10 мин
Винорелбин
Метотрексат
• Контейнеры с винорелбином и плюрониками устойчивы к диализу в течение 1 ч
• Контейнеры с метотрексатом и карбоксиметилированным хитозаном устойчивы к диализу
в течение 45 мин
• Разрушение контейнеров с метотрексатом и плюрониками начинается в течение 10 мин.
С чем в ытоге работали?
26

27.

Надо слайд про методику работы с клетками, название
клеток (аденокарциномы молочной железы человека)

28. Результаты поглощения контейнеров клетками

Справа надо цветом выделить назв
28

29. Результаты поглощения контейнеров клетками

Интенсивность флуоресценции клеток – должна быть
Результаты поглощения контейнеров клетками
1) Контейнеры поглощаются клетками
2) Флуоресценция наиболее заметна в цитоплазме, на ядерной мембране
и в ядрышках ядра. Доставка в ядро интересна для визуализации
доставки противораковых веществ
3) Сигнал контейнеров тройного агрегата выше, чем сигнал в отсутствие
аналита, это означает, что переносится именно контейнер с тройным
агрегатом.
29

30.

загнать на один слайд!! Читать их не будете, скажете,
что опказаны на слайде, и все.
1. Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами и
противоионом и показана возможность их использования для определения цефтриаксона,
блеомицина, метотрексата, винорелбина, бензилпенициллина в водном растворе на
уровне 0,1 мМ, а метотрексата и бензилпенициллина в искусственной моче на уровне 1
мМ.
2. Выявлено образование флуоресцирующего агрегата блеомицина с одноименно
заряженным полимером (блеомицин(2+) – полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) (+) –
додецилсульфат(–) – хлорофилл). В отсутствие ПГМГ («ко-иона») флуоресценция
агрегатов не отличается от флуоресценции контрольного опыта (без блеомицина). Для
ранее изученных модельных аналитов эффект ко-иона не наблюдали.
3. Взаимодействием тройных агрегатов (хлорофилла с модельными лекарственными
веществами и противоионами) с анионированными хитозанами или плюрониками
получены контейнеры для визуализации доставки цефтриаксона, метотрексата и
винорелбина в эукариотические клетки.
30

31. Выводы

4. Ковалентная сшивка контейнеров эпихлоргидрином не позволила получить
устойчивого сигнала модельных лекарственных веществ. Показана возможность
длительного сохранения флуоресценции выше сигнала контрольного опыта в
тройных агрегатах без полиэлектролита и несшитых контейнерах на основе
карбоксиметилированного и малеинированного хитозана и плюроников F-68 и 128.
5. Показано сохранение флуоресценции контейнеров винорелбин – лаурат –
плюроник F-68 (или F-128 или карбоксиметилированный хитозан) во время диализа
против фосфатно-солевого буфера по крайней мере в течение 2 ч (в отличие от
аналогичных контейнеров с метотрексатом, ПГМГ и ЦТАБом, разрушающихся за 20
мин).
6. Показано проникнование контейнеров с винорелбином, цефтриаксоном и
метотрексатом в клетки аденокарциномы молочной железы человека с
сохранением флуоресценции выше контрольного опыта. Наблюдали
распределение флуоресцирующих частиц в структуры цитоплазмы, ядерную
мембрану и ядрышко ядра.
31