Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

1. Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

Московский государственный университет
им. М.В.Ломоносова
Химический факультет
Кафедра аналитической химии
Лаборатория биоаналитических методов и оптических сенсорных систем
Видинчук Татьяна
Анатольевна
Студентка 6 курса
Руководитель
д.х.н., в.н.с. Беклемишев М.К.
Москва · 2023

2. Литературные данные

• Хлорофилл, зеленый пигмент растений, - доступный длинноволновый
флуорофор ( em = сколько нм)
• Немодифицированный хлорофилл как флуориметрический реагент
предложено использовать С.А.Захаренковой в 2021 г.*
• Визуализация доставки гидрофильных лекарственных веществ в виде
агрегатов с карбоцианиновыми флуорофорами предложена ею же.**
• Однако не все карбоцианины коммерчески доступны.
• Карбоцианины обладают собственной токсичностью.
• Хлорофилл как флуорофор для визуализации доставки лекарственных
веществ не изучен.
* Zakharenkova S.A. e.a. ACS Sustain. Chem. Eng. 2021, 9, 3408–3415
** Zakharenkova S.A. e.a. Molecules, 2021, 26, 7426.
2

3. Цель работы:

Использование хлорофилла как флуорофора для определения
лекарственных веществ и визуализации их доставки в
эукариотические клетки
Задачи:
• Показать возможность флуориметрического определения
цефтриаксона, блеомицина, винорелбина, метотрексата и
бензилпенициллина в воде и искуственной моче в виде тройных
агрегатов аналит-краситель-противоион.
• Выбрать системы для визуализации доставки этих соединений с
использований хитозанов и плюроников.
3
3

4. Методика работы. Схема визуализатора

Схема устройства регистрации флуоресценции в БИК-диапазоне:
1 – фотокамера, оснащенная светофильтром, пропускающим излучение с длиной волны более 700 нм,
2 – одиннадцать красных светодиодов с максимумом излучения 660 нм,
3 – алюминиевый радиатор для охлаждения светодиодов,
4 – 96-луночный планшет с образцами,
5 – светонепроницаемый кожух
5

5. Выделение хлорофилла из шпината

• Экстракция смесью ацетона и гексана (1:1 об.)
• Удаление экстрагента испарением
• Растворение полученного остатка в ацетоне
• Разделение смеси на фракции методом ТСХ
• Десорбция (чем)
5

6. Спектры поглощения и флуоресценции выделенных фракций

Выделенные фракции поглощают в различных областях спектра. Благодаря этому нам
удалось распознать фракции хлорофилла «а» и «b».
Хлорофилл а активно флуоресцирует, в то время как хлорофилл b не даёт сигнала.
6

7. Выбор условий определения цефтриаксона

Условия определения
цефтриаксона и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 30-40 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (1 г/л) 60 мкл;
• ЦТАБ (0,01 м) 10 мкл;
• цефтриаксон (0,005 М в воде)
100 мкл.
7

8. Выбор условий определения бензилпенициллина

Условия определения
бензилпенициллина и получения
тройных агрегатов для контейнеров
на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 10-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• бензилпенициллин (0,005 М) 150 мкл.
8

9. Сочетание хлорофилл-ПГМГ-ДДС

Флуоресценция тройного агрегата с блеомицином малостабильна, флуоресценция контроля
и тройного агрегата с блеомицином сразу после приготовления отличается почти вдвое,
однако в течение 10 минут практически исчезает.
9

10. Выбор условий определения блеомицина

Условия определения
блеомицина и получения
тройных агрегатов для контейнеров
на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 10 мкл;
• буфер бура (рН=8,5/9,2) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (1 г/л) 20 мкл;
• ДДС (0,008 м) 10 мкл;
• блеомицин (0,005 М в воде) 10
мкл.
10

11. Выбор условий определения винорелбина

Условия определения
винорелбина и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 15 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 м) 10 мкл;
• винорелбин (0,0093 М в
воде) 10 мкл.
11

12. Возможность образования тройных агрегатов с одноимённо заряженными ПАВ

Винорелбин способен образовывать тройные агрегаты как с катионными, так и с анионным
ПАВ (ЦТАБ и ДДС). Добавление ПГМГ в качестве коиона улучшает разницу
контроль/неконтроль.
12

13. Выбор условий определения метотрексата

Условия определения
метотрексата и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб в 10 раз)
15-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (1 г/л) 20-40 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• метотрексат (0,005 М) 100
мкл.
13

14. Определение в водном растворе

14

15. Определение в моче

15

16. Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами и противоионом и показана возможность их использования для

Характеристики методик определения лекарственных веществ
в воде и искусственной моче
Аналит
блеомицин
Предел
Общее число
Линейный
Предел
Общее число
Линейный
обнаружения
точек при
диапазон
обнаружения в
точек при
диапазон
в воде, М
определении
при
моче, М
определении
при
в воде
определен
в моче
определен
1,1Е-04
12
ии в воде,
ии в моче,
М
М
От 1,1Е-04
-
-
-
-
-
-
7,6Е-04
14
От 7,6Е-04
до 1,7Е-04
винорелбин
3,4Е-04
20
От 3,4Е-04
до 6,5Е-04
метотрексат
1,4Е-04
12
От 1,4Е-04
до 5,0Е-04
пензилпенициллин
4,5Е-05
15
От 4,0Е-05
до 2,7Е-04
16
до 2,7Е-04
1,0Е-03
22
От 1,0Е-03
до 1,2Е-03

17. Эффект ко-иона в системе хлорофилл-ПГМГ-ДДС-блеомицин

ПГМГ является коионом по отношению к блеомицину, без ПГМГ тройные агрегаты
хлорофилл-ПАВ-блео флуоресцируют на уровне контрольного опыта (без блеомицина).
Флуоресценция возрастает в диапазоне концентраций ПГМГ (1 г/л) от 0 до 20 мкл.
Эффект коиона наблюдается только с блеомицином.
17

18. Контейнеры с цефтриаксоном и метотрексатом для визуализации доставки

Для контейнеров с цефтриаксоном в качестве полимеров выбраны немодифицированный,
карбоксиметилированный и малеинированный хитозаны.
Полученные системы содержат частицы размером 10-1000 нм и дзета-потенциалами около 0 мВ.
Для контейнеров с метотрексатом в качестве полимеров выбраны плюроники F-68 и F-127.
18

19. Контейнеры с винорелбином для визуализации доставки

Для контейнеров с винорелбином в качестве полимеров выбраны плюроники F-68 и F-127,
несульфатированный и сульфатированный малениированные хитозанами.
Причём только контейнеры с карб. хит. сохраняют флуоресценцию после осаждения.
Без осаждения другие полимеры дали слабо флуоресцирующий осадок, дающий сигнал на
уровне контрольного опыта.
19

20. Выбор полимеров для контейнеров

Аналит
Полимер
Цефтриаксон
Немодифицированный хитозан
Карбоксиметилированный хитозан
Малениированный хитозан
Метотрексат
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Винорелбин
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Малениированный хитозан несульф.
Малениированный хитозан сульф.
20

21. Ковалентная сшивка контейнеров с винорелбином эпихлоргидрином

В сшитых эпихлоридом контейнерах с винорелбином и
хитозанами нет разницы контроль/неконтроль.
21

22. Сохранение флуоресценции в тройных агрегатах и несшитых и сшитых глутаром контейнерах с цефтриаксоном.

В течение 2-х суток уменьшается разница контроль/неконтроль в случае тройных агрегатов с
цефтриаксоном. Сохраняется в случае несшитых контейнеров с немод. хит. а в выводе у нас карб и
мал и плюроники, это весенние данные. А сильное увеличение сигнала со сшитыми может быть
связано с выталкиванием цефтриаксона из агрегатов.То есть таким образом и комментировать?
22

23. Сохранение флуоресценции в тройных агрегатах с винорелбином.

Флуоресценция тройных агрегатов с винорелбином сохраняется в течение 2-х суток в том
случае, если в качестве ПАВ использованы ПГМГ+ДДС или лаурат в ацетоне, в случае
лаурата в воде разница контроль/неконтроль появляется через сутки.
23

24. Сохранение флуоресценции в несшитых контейнерах с винорелбином.

Возможна замена токсичного ДДС на лаурат в ацетоне в случае тройного агрегата с
винорелбином и контейнеров с винорелбином и карбоксиметилированным,
малеинированным сульфатированным хитозанами, плюроником F-68. В системах с лауратом
флуореценция через сутки возрастает.
24

25.

25

26. Устойчивость к диализу несшитых контейнеров

Состав контейнера
Время диализа до разрушения контейнера
Аналит
полимер
ПАВ
Винорелбин
Плюроник F-68
Лаурат в ДМСО
1 час
Винорелбин
Плюроник F-127
Лаурат в ДМСО
1 час
Метотрексат
Карб. хит.
ЦТАБ-ПГМГ
45 минут
Метотрексат
Плюроник F-68
ЦТАБ-ПГМГ
10 минут
Метотрексат
Плюроник F-127
ЦТАБ-ПГМГ
10 минут
Контейнеры с винорелбином и плюрониками устойчивы к диализу в течение часа,
контейнеры с метотрексатом и карбоксиметилированным хитозаном также устойчивы к
диализу по крайней мере в течение 45 минут. Разрушение контейнеров с метотрексатом и
плюрониками начинается в течение 10 минут.
26

27. Результаты эндоцитоза

27

28. Результаты эндоцитоза

Интенсивность флуоресценции клеток
Результаты эндоцитоза
1) Есть поглощение контейнеров клетками
2) Флуоресценция наиболее заметна в цитоплазме, на ядерной мембране
и в ядрышках ядра клеток после интернализации контейнеров.
Доставка в ядро интересна для визуализации доставки противораковых
веществ
3) Сигнал контейнеров тройного агрегата выше, чем сигнал в отсутствие
аналита, это означает, что переносится именно контейнер с тройным
агрегатом.
28

29. Выводы

1. Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами и
противоионом и показана возможность их использования для определения цефтриаксона,
блеомицина, метотрексата, винорелбина, бензилпенициллина в водном растворе на
уровне 0,1 мМ, а метотрексата и бензилпенициллина в искусственной моче на уровне 1
мМ.
2. Выявлено образование флуоресцирующего агрегата блеомицина с одноименно
заряженным полимером (блеомицин(2+) – полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) (+) –
додецилсульфат(–) – хлорофилл). В отсутствие ПГМГ («ко-иона») флуоресценция
агрегатов не отличается от флуоресценции контрольного опыта (без блеомицина). Для
ранее изученных модельных аналитов эффект ко-иона не наблюдали.
3. Взаимодействием тройных агрегатов (хлорофилла с модельными лекарственными
веществами и противоионами) с анионированными хитозанами или плюрониками
получены контейнеры для визуализации доставки цефтриаксона, метотрексата и
винорелбина в эукариотические клетки.
29

30. Выводы

4. Ковалентная сшивка контейнеров эпихлоргидрином не позволила получить
устойчивого сигнала модельных лекарственных веществ. Показана возможность
длительного сохранения флуоресценции выше сигнала контрольного опыта в
тройных агрегатах без полиэлектролита и несшитых контейнерах на основе
карбоксиметилированного и малеинированного хитозана и плюроников F-68 и 128.
5. Показано сохранение флуоресценции контейнеров винорелбин – лаурат –
плюроник F-68 (или F-128 или карбоксиметилированный хитозан) во время диализа
против фосфатно-солевого буфера по крайней мере в течение 2 ч (в отличие от
аналогичных контейнеров с метотрексатом, ПГМГ и ЦТАБом, разрушающихся за 20
мин).
6. Показано проникнование контейнеров с винорелбином, цефтриаксоном и
метотрексатом в клетки аденокарциномы молочной железы человека с
сохранением флуоресценции выше контрольного опыта. Наблюдали
распределение флуоресцирующих частиц в структуры цитоплазмы, ядерную
мембрану и ядрышко ядра.
30