Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

1. Использование хлорофилла как флуорофора для визуализации и определения гидрофильных соединений

Московский государственный университет
им. М.В.Ломоносова
Химический факультет
Кафедра аналитической химии
Лаборатория биоаналитических методов анализа и оптических сенсорных систем
Видинчук Татьяна
Анатольевна
Студентка 6 курса
Руководитель
д.х.н., в.н.с. Беклемишев М.К.
Москва · 2023

2. Литературные данные

• Хлорофилл – зелёный пигмент растений, доступный длинноволновый
флуорофор (λem=680 нм)
• Немодифицированный хлорофилл как флуориметрический реагент
предложено использовать С.А.Захаренковой и др. в 2021 г.*
• Визуализация доставки гидрофильных соединений с использованием
карбоцианиновых флуорофоров предложена ею же. **
• Не все карбоцианины коммерчески доступны.
• Карбоцианины обладают собственной токсичностью.
• Хлорофилл как флуорофор для визуализации доставки лекарственных
веществ не изучен.
* Zakharenkova S.A. e.a. ACS Sustain. Chem. Eng. 2021, 9, 3408.
** Zakharenkova S.A. e.a. Molecules, 2021, 26, 7426.
2

3. Цель работы:

Использование хлорофилла как флуорофора для определения
лекарственных веществ и визуализации их доставки в
эукариотические клетки
Задачи:
• Показать возможность флуориметрического определения
цефтриаксона, блеомицина, винорелбина, метотрексата и
бензилпенициллина в воде и искуственной моче в виде тройных
агрегатов аналит-краситель-противоион.
• Выбрать системы для визуализации доставки этих соединений с
использований хитозанов и плюроников.
3
3

4. Методика. Схема визуализатора

Схема устройства регистрации флуоресценции в БИК-диапазоне:
1 – фотокамера, оснащенная светофильтром, пропускающим излучение с длиной волны более 700 нм,
2 – одиннадцать последовательно закрепленных красных светодиодов с максимумом излучения 660
нм,
3 – алюминиевый радиатор для охлаждения светодиодов,
4 – 96-луночный планшет с образцами,
5 – светонепроницаемый кожух
5

5. Выделение хлорофилла из шпината

• Экстракция смесью ацетона и гексана (1:1 об.)
• Удаление экстрагента испарением
• Растворение полученного остатка в ацетоне
• Разделение смеси на фракции методом ТСХ
• Десорбция ацетоном
5

6. Спектры выделенных фракций

Спектры поглощения
Выделенные фракции распознавали,
сравнивая спектры фракций с
литературными спектрами «a» и «b».
Спектры флуоресценции
Хлорофилл а флуоресцирует, а хлорофилл b – нет.
Далее использовали хлорофилл а.
6

7. Выбор условий определения цефтриаксона

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с цефтриаксоном
от концентраций компонентов
Условия определения
цефтриаксона и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 30-40 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 60 мкл;
• ЦТАБ (0,01 м) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 100
мкл.
а) ПГМГ', б) цефтриаксона, в) ЦТАБ, г) времени.
'ПГМГ - Полигексаметиленгуанидин
7

8. Выбор условий определения бензилпенициллином

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с
бензилпенициллина от концентраций компонентов
Условия определения
бензилпенициллина и получения
тройных агрегатов для контейнеров
на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 10-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 100 мкл.
а) природы ПАВ, б) бензилпенициллина.
8

9. Выбор условий определения блеомицина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с цефтриаксоном от концентраций компонентов
Условия определения
блеомицина и получения
тройных агрегатов для контейнеров
на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 10 мкл;
• буфер бура (рН=8,5/9,2) 30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 20 мкл;
• ДДС (0,008 м) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 10 мкл.
а) рН, б) ПГМГ, в) ДДС', г) блеомицина, д) метанола.
‘ДДС – додецилсульфат натрия
9

10. Выбор условий определения винорелбина

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с винорелбином от концентраций компонентов
Условия определения
винорелбина и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб) 15 мкл;
• фосфатный буфер (рН=7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• Анализируемый раствор 10
мкл.
а) ПГМГ, б) ЦТАБ', в)винорелбина, г) винорелбина и времени.
'Цетилтриметиламмония бромид
10

11. Возможность образования тройных агрегатов с одноимённо заряженными ПАВ

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с винорелбином от природы ПАВ
• Винорелбин способен образовывать тройные агрегаты как с катионными, так и с
анионным ПАВ (ЦТАБ и ДДС).
• Добавление ПГМГ в качестве коиона улучшает разность сигнала и контрольного опыта.
11

12. Эффект ко-иона в системе хлорофилл-ПГМГ-ДДС-блеомицин

Зависимость флуоресценции тройного агрегата с блеомицином от концентрации ПГМГ
• Без ПГМГ тройные агрегаты хлорофилл-ПАВ-блео флуоресцируют на уровне контрольного
опыта (без блеомицина).
• ПГМГ является коионом по отношению к блеомицину: флуоресценция возрастает в
диапазоне концентраций ПГМГ (0,0056 М) от 0 до 20 мкл.
• Эффект ПГМГ-коиона наблюдается только с блеомицином.
12

13. Выбор условий определения метотрексата

Зависимость флуоресценции тройного агрегата
с метотрексатом от концентраций компонентов
а) природы ПАВ, б) ПГМГ, в) ЦТАБ, г) метотрексата.
13
Условия определения
метотрексата и получения
тройных агрегатов для
контейнеров на 300 мкл:
• хлорофилл (разб в 10 раз)
15-20 мкл;
• фосфатный буфер (рН 7,4)
30 мкл;
• вода до 300 мкл;
• ПГМГ (0,0056 М) 20-40 мкл;
• ЦТАБ (0,01 М) 10 мкл;
• Анализируемый раствор
100 мкл.

14. Определение лекарственных веществ в водном растворе

Зависимость флуоресценции тройного агрегата от концентраций аналита:
а) блеомицина, б) винорелбина, в) метотрексата, г) бензилпенициллина.
а)
б)
в)
г)
14

15. Определение метотрексата и бензилпенициллина в моче

Зависимость флуоресценции тройного агрегата от концентраций
аналита: а) метотрексата, б) бензилпенициллина.
а)
б)
15

16. - Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами и противоионом - Показана возможность их использования для

Характеристики методик определения лекарственных веществ
в воде и искусственной моче
В воде
Аналит
В моче
Предел
Общее число
Линейный
Предел
Общее число
Линейный
обнаружения, М
точек
диапазон, М
обнаружения, М
точек
диапазон, М
Блеомицин
1,1Е-04
12
(1,1-1,7)Е-04
-
-
-
Винорелбин
3,4Е-04
20
(3,4-6,5)Е-04
-
-
-
Метотрексат
1,4Е-04
12
(1,4-5,0)Е-04
7,6Е-04
14
(7,6-2,7)Е-04
Бензилпенициллин
4,5Е-05
15
(4,0-2,7)Е-05
1,0Е-03
22
-
16

17.

Контейнеры для визуализации доставки
лекарственных веществ
17

18. Контейнеры с цефтриаксоном и метотрексатом для визуализации доставки

Зависимость флуоресценции от природы полимера контейнеров с а) цефтриаксоном б) метотрексатом
а)
б)
• Для контейнеров с цефтриаксоном в качестве полимеров выбраны немодифицированный,
карбоксиметилированный и малеинированный хитозаны.
• Для контейнеров с метотрексатом в качестве полимеров выбраны плюроники F-68 и F-127.
• Частицы: размер 10-1000 нм, дзета-потенциалы около 0 мВ.
18

19. Контейнеры с винорелбином для визуализации доставки

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином а) от природы полимера
б) природы полимера и осаждения
а)
б)
• Для получения контейнеров с винорелбином изучены плюроники F-68 и F-127,
несульфатированный и сульфатированный малениированные хитозаны.
• Только контейнеры с карбоксиметилированным хитозаном сохраняют
флуоресценцию после выделения осаждением.
• Другие полимеры дают осадок, флуоресцирующий на уровне контрольного опыта.
19

20. Выбор полимеров для контейнеров (оптимальное)

Аналит
Полимер
Немодифицированный хитозан
Цефтриаксон
Карбоксиметилированный хитозан
Малениированный хитозан
Метотрексат
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Плюроник F-68
Плюроник F-127
Винорелбин
Малениированный хитозан несульф.
Малениированный хитозан сульф.
Сокращения: сульф. – сульфатированный
20

21. Ковалентная сшивка контейнеров с винорелбином эпихлоргидрином

Зависимость флуоресценции контейнеров
с винорелбином от природы хитозана
• В сшитых контейнерах с винорелбином и хитозанами нет
разности с контрольным опытом
• Переход к работе с несшитыми контейнерами
21

22. Сохранение флуоресценции в тройных агрегатах и несшитых и сшитых глутаром контейнерах с цефтриаксоном.

Зависимость флуоресценции контейнеров с цефтриаксоном
от природы хитозана и времени
В течение 2-х суток уменьшается разница контроль/неконтроль в случае тройных агрегатов с
цефтриаксоном. Сохраняется в случае несшитых контейнеров с немод. хит. а в выводе у нас карб и
мал и плюроники, это весенние данные. А сильное увеличение сигнала со сшитыми может быть
связано с выталкиванием цефтриаксона из агрегатов.То есть таким образом и комментировать?
Сокращения: хит. – хитозан; немод. – немодифицированный;
карб. – карбоксиметилированный; мал. – малеинированный.
22

23. Сохранение флуоресценции в тройных агрегатах с винорелбином.

Зависимость флуоресценции контейнеров с цефтриаксоном от природы ПАВ и времени
Флуоресценция тройных агрегатов с винорелбином сохраняется в течение 2-х суток в том
случае, если в качестве ПАВ использованы ПГМГ+ДДС или лаурат в ацетоне, в случае
лаурата в воде разница контроль/неконтроль появляется через сутки.
23

24. Сохранение флуоресценции в несшитых контейнерах с винорелбином.

Зависимость флуоресценции контейнеров с винорелбином от природы ПАВ, природы хитозана и времени
Возможна замена токсичного ДДС на лаурат в ацетоне в случае тройного агрегата с
винорелбином и контейнеров с винорелбином и карбоксиметилированным,
малеинированным сульфатированным хитозанами, плюроником F-68. В системах с лауратом
флуореценция через сутки возрастает.
24

25.

25

26. Устойчивость к диализу несшитых контейнеров

Состав контейнера
Время диализа до разрушения контейнера
Аналит
полимер
ПАВ
Винорелбин
Плюроник F-68
Лаурат в ДМСО
1 час
Винорелбин
Плюроник F-127
Лаурат в ДМСО
1 час
Метотрексат
Карб. хит.
ЦТАБ-ПГМГ
45 минут
Метотрексат
Плюроник F-68
ЦТАБ-ПГМГ
10 минут
Метотрексат
Плюроник F-127
ЦТАБ-ПГМГ
10 минут
Контейнеры с винорелбином и плюрониками устойчивы к диализу в течение часа,
контейнеры с метотрексатом и карбоксиметилированным хитозаном также устойчивы к
диализу по крайней мере в течение 45 минут. Разрушение контейнеров с метотрексатом и
плюрониками начинается в течение 10 минут.
26

27. Результаты эндоцитоза

27

28. Результаты эндоцитоза

Интенсивность флуоресценции клеток
Результаты эндоцитоза
1) Есть поглощение контейнеров клетками
2) Флуоресценция наиболее заметна в цитоплазме, на ядерной мембране
и в ядрышках ядра клеток после интернализации контейнеров.
Доставка в ядро интересна для визуализации доставки противораковых
веществ
3) Сигнал контейнеров тройного агрегата выше, чем сигнал в отсутствие
аналита, это означает, что переносится именно контейнер с тройным
агрегатом.
28

29. Выводы

1. Получены флуоресцирующие тройные агрегаты хлорофилла а с аналитами и
противоионом и показана возможность их использования для определения цефтриаксона,
блеомицина, метотрексата, винорелбина, бензилпенициллина в водном растворе на
уровне 0,1 мМ, а метотрексата и бензилпенициллина в искусственной моче на уровне 1
мМ.
2. Выявлено образование флуоресцирующего агрегата блеомицина с одноименно
заряженным полимером (блеомицин(2+) – полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) (+) –
додецилсульфат(–) – хлорофилл). В отсутствие ПГМГ («ко-иона») флуоресценция
агрегатов не отличается от флуоресценции контрольного опыта (без блеомицина). Для
ранее изученных модельных аналитов эффект ко-иона не наблюдали.
3. Взаимодействием тройных агрегатов (хлорофилла с модельными лекарственными
веществами и противоионами) с анионированными хитозанами или плюрониками
получены контейнеры для визуализации доставки цефтриаксона, метотрексата и
винорелбина в эукариотические клетки.
29

30. Выводы

4. Ковалентная сшивка контейнеров эпихлоргидрином не позволила получить
устойчивого сигнала модельных лекарственных веществ. Показана возможность
длительного сохранения флуоресценции выше сигнала контрольного опыта в
тройных агрегатах без полиэлектролита и несшитых контейнерах на основе
карбоксиметилированного и малеинированного хитозана и плюроников F-68 и 128.
5. Показано сохранение флуоресценции контейнеров винорелбин – лаурат –
плюроник F-68 (или F-128 или карбоксиметилированный хитозан) во время диализа
против фосфатно-солевого буфера по крайней мере в течение 2 ч (в отличие от
аналогичных контейнеров с метотрексатом, ПГМГ и ЦТАБом, разрушающихся за 20
мин).
6. Показано проникнование контейнеров с винорелбином, цефтриаксоном и
метотрексатом в клетки аденокарциномы молочной железы человека с
сохранением флуоресценции выше контрольного опыта. Наблюдали
распределение флуоресцирующих частиц в структуры цитоплазмы, ядерную
мембрану и ядрышко ядра.
30