Клеточная и тканевая биотехнология в селекции и растениеводстве

1. Клеточная и тканевая биотехнология в селекции и растениеводстве

29.01.17

2.

• Клеточная инженерия (биотехнология) - одно из
наиболее важных направлений в биотехнологии.
• Используется принципиально новый объект изолированная
культура
клеток
и
тканей
эукариотических организмов.

3.

Термин «культура клеток, органов и тканей»
применяется к асептически выращиваемым частям
растений:
изолированным зародышам
изолированным органам (кончики корней, меристемы
побегов, листовые примордии, части молодых цветков и
плодов)
каллусные ткани на агаризованной среде
суспензионная культура клеток и небольших агрегатов
в жидкой среде
культура протопластов.

4.

Клеточная биотехнология базируется:
• на
способности
клеток
к
существовании и размножении in vitro, их
тотипотентности и регенерации.

5.

Тотипотентность –
способность клеток реализовывать
свой потенциал развития и давать
начало
образованию
целого
растения
при
определенных
условиях культивирования.

6. Применение методов культуры клеток, органов, тканей растений и основные направления

1.
Ведущая роль клеточных культур в фундаментальных
исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и
цитологии растений.
Культуры клеток являются
биологической системой.
новой
экспериментально
созданной
Культуры клеток и тканей могут служить адекватной моделью при
изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого
растения.
2. Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как
типичные микрообъекты.
Культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при
которой из культивируемой соматической клетки возникает целое
растение, способное к росту и размножению.

7.

Решение теоретических проблем:
- особенности старения растительной клетки и апоптоз;
- проблемы цитодифференцировки и морфогенеза;
- роль фитогормонов, углеводов, витаминов, минеральных веществ при
каллусогенезе, органогенезе, морфогенезе;
- механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам
среды: абиотическим факторам (засолению, кислой среде, низким
температурам и т.д.), биотическим факторам (патогенам разного
происхождения);
-
взаимоотношение клеток высших растений
бактериями и микоризными грибами;
с
клубеньковыми
- регуляция вторичного обмена;
- механизмы опухолеобразования;
- механизмы сомаклональной измненчивости;
- популяционные взаимоотношения в клеточной культуре.

8. Направления клеточной технологии

1.
Получение биологически активных веществ растительного
происхождения:
традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов,
гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов,
имеющих медицинское применение);
диосгенин из клеток диоскореи, аймолин из клеток раувольфии
змеиной, тонизирующие вещества из клеток женьшеня, используемые
в медицине и парфюмерии.
синтез новых необычных соединений;
культивируемые в суспензии клетки могут применятся как
мультиферментные системы, способные к широкому спектру
биотрансформаций химических веществ (реакции окисления,
восстановления,
гидроксилирования,
метилирования,
деметилирования, гликолизирования, изомеризации).

9.

2. Использование культуры изолированных тканей для размножения и
оздоровления посадочного материала метод клонального
микроразмножения растений
Возможности:
получение от одной меристемы от 10000 до 1000000 растений в год,
причем все они будут генетически идентичны.
получение безвирусных растений.
3. Использование изолированных клеток в селекции растений облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс.
Две группы методов:
вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную
селекцию, а служат ей;
получение новых форм и сортов растений самостоятельными
методами, селекция ведется независимо от традиционных методов
селекции.

10.

Вспомогательные методы
оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости позволяет преодолеть нескрещиваемость некоторых растений)
культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей
(преодоление постгамной несовместимости - позволяет получать
растения из невсхожих (с плохо развитым эндоспермом) гибридных
семян.)
получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор
криосохранение изолированных клеток, тканей и органов
клональное микроразмножение отдаленных гибридов.

11.

Самостоятельные методы
клеточная селекция с использованием каллусной ткани
Тканевые культуры могут производить регенеранты, фенотипически
и генотипически отличающиеся от исходного материала в результате
сомаклонального варьирования. При этом в некоторых случаях можно
обойтись без мутагенной обработки.
соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов
и получение неполовых гибридов)
применение методов генной инженерии.
Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.

12. История метода

Идея о возможности культивирования клеток растений вне организма
была высказана еще в конце XIX в.
Впервые удалось ввести в культуры клетки животных, что было
осуществлено в начале XX в.
Первые успехи в области культивирования
относятся к 30-м годам.
растительных клеток
Бурное развитие нового направления работ с клетками растений и
животных происходит в 60—70-е годы XX в.

13.

I этап (1892—1902 гг.)
Связан с именами таких немецких исследователей, как Г. Хаберландт,
Г. Фёхтинг, К. Рехингер.
Пытались культивировать в растворе сахарозы различные растительные
ткани, группы клеток, волоски.
Длительно растущих in vitro культур они не получили.
К. Рехингер получил первичный каллус и определил минимальный размер
сегмента, способного к каллусогенезу - не менее 1,5 мм.
Г. Фехтинг - полярность присуща не только органам растения, но и отдельной
клетке.
Г. Хаберландт выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой
растительной клетки.
Исследования Хаберландта с фотосинтезирующими клетками были неудачны.
Упустил из виду, что ассимилирующие зеленые клетки - зрелые и
высокодифференцированные, потеряли способность к меристематической
деятельности.

14.

II этап (1902—1922 гг.)
Создание первых питательных сред для культивирования тканей
животных. Среды были природного происхождения и содержали, как
правило, плазму крови и зародышевую жидкость.
III э т а п (1922—1932 гг.).
Американский ученый В. Роббинс и немецкий ученый Котте показали
возможность культивирования на твердых питательных средах
меристемы кончиков корня томатов и кукурузы. Однако через
определенное время растительные ткани бурели и погибали.
Подлинное развитие метода культуры тканей растений началось с 1932
г.
IV э т а п (1932—1940 гг.)
Совершенствование метода культуры тканей и клеток высших растений. - работы американского исследователя Ф. Уайта и французского Р.
Готре (1932 —1934).
Они повторили опыт В. Роббинса и Котте, показав возможность долгого
культивирования в условиях in vitro растительных тканей за счет
периодического пересаживания их на свежую питательную среду.

15.

V э т а п (1940—1960 гг.).
Список используемых видов растений, ткани которых выращивались
in vitro, включал 142 вида.
Были разработаны составы питательных сред, изучено значение
макро и микроэлементов, выявлена потребность в витаминах и
стимуляторах роста для поддержания нормальной ростовой активности
ткани.
С открытием в 1955 г. нового класса фитогормонов - цитокининов, и в
частности кинетина, была получена возможность стимулировать деление
клеток кусочка ткани сердцевинной паренхимы табака, лишенной
проводящих пучков и камбия.
В это же время разработаны методы получения и выращивания
клеточных суспензий, а также культивирования отдельной клетки, деление
которой индуцируется с помощью ткани-няньки.

16.

VI э т а п (1960—1975 гг.).
Профессор Готтингемского университета Э.К. Коккинг разработал
метод получения ферментативным путем (обработка смесью
пектолитических и целлюлитических ферментов)
изолированных
протопластов из тканей корня и плодов томата и культивирования их в
контролируемых условиях.
1970 г. - в той же лаборатории Пауэром и сотр. было осуществлено
искусственное слияние протопластов, что открыло новый путь к
созданию соматических гибридов.
Разработан метод — микроразмножение растений в условиях in
vitro с использованием меристемной культуры.
Первоначально этот метод был разработан французским ученым
Ж. Морелем для получения оздоровленного посадочного материала
орхидей.

17.

VII этап (1975 г.— по настоящее время).
Продолжается быстрое развитие техники in vitro, изучение биологии
культивируемых объектов, разрабатываются методы электрослияния
изолированных протопластов, методы мутагенеза и клеточной селекции,
методы получения гаплоидных растений, совершенствуется метод
глубинного культивирования клеток.
С использованием изолированных протопластов и векторов,
созданных на основе Тi- и Ri-плазмид Аgrobaсterium tumifaziens и A.
rhizogenes, с помощью методов генной инженерии разработан
эффективный метод переноса генов для двудольных растений.
Таким образом, за последние десятилетия был сделан большой шаг
вперед в развитии технических приемов работы с изолированными
тканями и клетками растений.
Однако объектом исследования, как правило, служили однодольные и
двудольные травянистые растения и в редких случаях — древесные.

18. Техника введения в культуру in vitro и культивирование изолированных клеток и тканей растений

Стерилизация
• Введение в
культуру, пересадка
на свежую
питательную
среду)проводят в асептическом помещении (ламинар-боксе, где
асептика достигается постоянной подачей стерильного воздуха в
рабочий объем) стерильными инструментами.
• Стерильность надо соблюдать и во время культивирования
изолированных тканей.
• Для стерилизации экспланта наиболее часто применяют гипохлорит
натрия. Концентрированный раствор (10-14 %) разводят водой в 10 раз.
• Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С и
давлении 0,75—1 атм в течение 20 мин.
• Чистую посуду, предварительно завернутую в фольгу или оберточную
бумагу, стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160°С в
течение двух часов.

19.

20.

Состав питательных сред
макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу,
железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.),
витамины
углеводы - чаще всего в качестве углевода используют сахарозу
или глюкозу в концентрации 2-3%.
фитогормоны или их синтетические аналоги. Фитогормоны
необходимы для дедифференцировки клеток и для индукции клеточных
делений.
В настоящее время известно большое число различных по
составу питательных сред – Мурасиге и Скуга, 1962; Гамборга и
Эвеленга, 1968; Уайта, 1939; Нича и Нич, 1974-1975; ШенкаГильдебранта, Грессхофф-Доу.
Наиболее часто применяемая при выращивании изолированных
растительных тканей в условиях in vitro среда Т. Мурасига и Ф. Скуга,
впервые составленная в 1962 г.

21. Культура каллусных тканей

22.

В основе культивирования растительных
клеток лежит свойство тотипотентности.
Г. Хаберландт выдвинул гипотезу о
тотипотентности
любой
живой
растительной клетки.

23.

Тотипотентность —
это
свойство
клетки
реализовывать
генетическую информацию, обеспечивающую
её дифференцировку и развитие до целого
организма.
Растительная клетка способна при определенных
условиях вторично дифференцироваться и под
влиянием внешних условий выбирать тот или иной
путь морфогенеза.

24.

.
Тотипотентностью
обладают
оплодотворенная
яйцеклетка растений и яйцо животных организмов.
Клетки, изолированные из эмбрионов млекопитающих,
в
условиях культивирования
способны
сохранять
плюрипотентность — способность дифференцироваться
во все типы клеток как собственно зародыша, так и
экстраэмбриональных тканей.
Такие клетки получили название эмбриональных
стволовых клеток.

25.

Все виды растений сохраняют тотипотентность своих соматических клеток.
Задача выявить культуральные условия, необходимые для реализации этой
тотипотентности.
Особые трудности возникают при получении регенерантов из
однодольных растений, таких как пшеница, ячмень, кукуруза, рис.
Любая растительная клетка обладает одинаковыми потенциальными
возможностями, так как содержит весь набор генов и, следовательно, клетки
сохраняют свойственную зиготе программу развития.
Можно регенерировать целое растение из клеток лепестка цветка, или из
клеток сердцевинной паренхимы стебля, или из клеток любой ткани.
Однако свойство тотипотентности не всегда реализуется, так как
потенциальные возможности клеток разных типов проявляются неодинаково. В
некоторых из них гены в сильной степени репрессированы, в связи с чем
проявление тотипотентности становится ограниченным.

26.

• Растительная клетка предъявляет менее жесткие
требования к условиям культивирования в отличие от
животной.
• Основным типом культивируемой растительной
клетки является каллус.

27. Каллус Nicotiana tabacum

Каллус состоит из аморфной
массы
свободно
организованных тонкостенных
паренхиматозных
клеток,
развивающихся
из
клеток
родительских тканей.
27

28.

По Доддсу и Робертсу (Dodds, Roberts,
1985),
каллус
–
неорганизованная
меристематическая
или
опухолеподобная масса растительных
клеток, формирующихся in vitro.

29.

• Как полагает Батыгина (1987), каллус –
гетерогенная интегрированная структура,
образующаяся в результате пролиферации
клеток на поверхности отдельных структур
растительного организма;
• каллус формируется, как правило, из исходно
разных генеративных или вегетативных
органов;
• состоит из групп неоднородных клеток,
имеющих
морфогенетические
потенции,
которые реализуются различными путями
(эмбриоидогенез, органогенез, гистогенез).

30.

• Первые
работы,
посвященные
получению
каллуса
in
vitro
из
изолированных
частей
растений,
например, сегментов мезофилла листа,
и изучению каллусогенеза, появились
еще в конце 19-начале 20 века.

31.

В
дальнейшем
дедиференцированные
клетки специализируются как каллусные, т. е.
становятся
особым
образом
дифференцированными.
Каллусная ткань –
один
из
видов
клеточной
дифференцировки,
возникает
путем
неорганизованной
пролиферации
дедифференцированных клеток органов
растения.

32.

I этап (1892—1902 гг.)
Связан с именами таких немецких исследователей, как Г. Хаберландт,
Г. Фёхтинг, К. Рехингер.
Пытались культивировать в растворе сахарозы различные
растительные ткани, группы клеток, волоски.
Длительно растущих in vitro культур они не получили.
К. Рехингер получил первичный каллус и определил минимальный
размер сегмента, способного к каллусогенезу - не менее 1,5 мм.
Г. Фехтинг - полярность присуща не только органам растения, но и
отдельной клетке.
Г. Хаберландт - исследования с фотосинтезирующими клетками были
неудачны.
Упустил из виду, что ассимилирующие зеленые клетки - зрелые и
высокодифференцированные, потеряли способность к меристематической
деятельности.

33.

34.

Основа создания каллусной ткани – дедифференцировка.
В процессе дифференцировки клетки теряют способность
делиться.
• Дедифференцировка
–
это
возвращение
клеток
в
меристематическое состояние, при котором они сохраняют
способность к делению.
• Меристема – недифференцированная (образовательная)
ткань растения.
• Дедифференциация – потеря, утрата признаков, свойственных
дифференцированным клеткам; упрощение структуры клетки,
связанное с временной потерей их специализации.
При дедифференцировке ткани теряют структуру, характерную
для их специфических функций в растении, и возвращаются к
состоянию делящихся клеток

35.

• Особенности дедифференцировки клеток
экспланта и каллусогенеза зависят от
эпигенетических
характеристик
составляющих его тканей.

36.

• Клетки запасающей паренхимы корня и
стебля, мезофилла листа и других
специализированных
тканей,
эксплантированных на питательную
среду, содержащую минеральные соли,
источники
углерода,
витамины
и
гормоны,
должны
дедифференцироваться,
т.е. потерять структуру, характерную
для их специфических функций в
растении и вернуться к состоянию
делящейся клетки.

37.

Каллусные культуры, полученные из
отрезков органов, таких, как корни,
стебли, могут возникать из разных
типов
клеток,
присутствующих
в
исходной ткани.
• Так, взятый целиком фрагмент стебля
имеет в своем составе клетки –
эпидермальные, первичной коровой
паренхимы, камбия и сосудистой
системы, сердцевинной паренхимы.

38.

В разных условиях культивирования и
в
зависимости
от
различий
в
физиологическом состоянии исходного
растения
можно
наблюдать
преимущественную
пролиферацию
клеток камбия и его молодых
дериватов, коры и сердцевинной
паренхимы.

39.

• Различное тканевое происхождение
первичных каллусных клеток является
одной из причин гетерогенности
культуры каллусной ткани, так как
некоторые
функциональные
особенности
исходных
клеток
передаются
в
ряду
клеточных
поколений как стойкие модификации
или
эпигенетически
наследуемые
признаки.

40.

Если эксплант, используемый для получения каллуса, является
фрагментом органа, то имеет в своем составе эпидермальные клетки,
клетки камбия, сосудистой системы, сердцевинной и первичной
коровой паренхимы. Преимущественно пролиферируют клетки камбия,
коры, сердцевинной паренхимы.
• После помещения на питательную среду меристемы стебля
томатов отмечено:
прекращение митоза
клетки увеличиваются в размерах, теряют характерную для
меристематической ткани форму, изменяется структура ядра и
цитоплазмы
в готовящейся к делению клетке возрастает синтез всех форм РНК,
исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки,
специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани.
Эти наблюдения свидетельствуют об изменениях в
активности генов и белкового аппарата клетки при
дедифференцировке.

41.

Стадия развития растения, из
которой получен эксплант –
существенный фактор для инициации
культуры,
он
влияет
и
на
морфогенетические
свойства
длительно культивируемых тканей.

42.

• Онтогенетически
молодые
экспланты
(незрелые зародыши, семена) продуцируют
каллусы с более высокой долей морфотипов,
способных к регенерации проростков, по
сравнению с более зрелыми тканями.
• Характерно, что потенциал развития может
варьировать даже в пределах одного органа.
• Известно, что незрелые зародыши – это
экспланты с высоким морфогенетическим
потенциалом.

43. Каллус, образованный в культуре незрелых зародышей ячменя

43

44.

У интактных растений дедифферинцировка и
индукция каллусогенеза возникает при механическом
повреждении вследствие образования раневых гормонов
(травматиновая кислота).
Каллус может возникнуть и в результате пролиферации
внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью
среза из-за нарушения гормонального баланса.
Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается
на поверхности.

45.

Для получения каллусных тканей в условиях in
vitro в состав питательных сред должны
обязательно входить фитогормоны:
ауксины
вызывают
дедифференцировку
клеточную
цитокинины - индуцируют деление клеток.
На безгормональной среде растут опухолевые
и «привыкшие» ткани.

46.

Источники ауксинов –
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4Д),
индолил-3-уксусная кислота (ИУК),
нафтилуксусная кислота (НУК).
Для
получения
рыхлого
хорошо
растущего каллуса чаще применяют 2,4-Д,
так как ИУК почти в 30 раз менее активна,
чем 2,4-Д.

47.

Источников цитокининов
кинетин
6-бензиламинопурин (БАП),
зеатин.
6-БАП и зеатин проявляют более высокую
активность
в
поддержании
роста
изолированных
тканей
и
индукции
органогенеза по сравнению с кинетином. В
состав некоторых сред входит аденин.

48. Морфофизиологическая характеристика каллусных тканей

Выделяют два типа культивируемых растительных клеток:
нормальные - в культуре могут существовать в двух видах:
• в виде суспензии в жидкой питательной среде
• на поверхности твердой питательной среды в виде каллуса.
опухолевые • гормононезависимость
• лишены способности дать начало нормально организованным
структурам (корни, побеги) в процессе органогенеза

49.

• Из одного экспланта можно получить
различные морфотипы каллусных
культур.

50.

Например, для каллусных культур ячменя
выявили семь основных морфологических
типов клеток:
1. Гигантские, удлиненные, сильно вакуолизированные
клетки, без явно выраженного ядра (200-400 мкм);
2.
Молодые округлые паренхимные клетки без четко
выраженного ядра (40-60 мкм);
3. Меристематические клетки (15-50 мкм);
4. Большие клетки с зернистой цитоплазмой и большими
ядрами (50-100 мкм);
5. Мелкие меристематические клетки с сегментированным
типом деления (15-20 мкм);
6. Трахеиды;
7. Паренхимные клетки.

51.

Молодые паренхимные клетки ячменя
могли дифференцироваться во все
типы клеток в зависимости от
трофических и гормональных условий.

52.

• Поэтому культивируемые in vitro каллусные
ткани характеризуются высокой степенью
гетерогенности, даже в тех случаях, когда
они получены из одних и тех же донорных
генотипов, эксплантов и в одинаковых
условиях культивирования.
• Это
проявляется,
в
частности,
в
морфологической
и
структурной
разнокачественности каллусов, присутствии в
них разных типов тканей.

53.

• Каллусная
ткань,
выращиваемая
поверхностным способом, представляет
собой аморфную массу тонкостенных
паренхимных клеток, не имеющую строго
определенной анатомической структуры.

54.

55. В зависимости от происхождения и условий выращивания

Каллусная ткань
средней плотности,
с хорошо выраженными
меристематическими очагами
плотная, с зонами
Она может иметь in vitro
редуцированного
белый, желтоватый,
камбия
зеленый, красноватый
и сосудов.
цвета.
рыхлая

56.

• Каллусные культуры двух видов гречихи, полученные
из зародышей разного возраста, характеризовались
разнообразием морфологии.
• Показано, что приблизительно через неделю после
высаживания экспланта на каллусогенную среду на
нем начинал нарастать каллус.
• Первичный каллус был серого или белого цвета,
водянистой консистенции и лишь позже начинал
формироваться гетерогенный узловатый каллус.
Это, вероятно, связано с тем, что в начале
пролиферации клеток разных тканей существует
временная разница.

57.

а
Рис. Рыхлый каллус
F. еsculentum:
а - морфология рыхлого каллуса
Рис. Рыхлый каллус F. Tataricum.
Быстро нарастающий.
Сильно оводненный, легко распадающийся на отдельные
клетки; не имеет глобулярного характера.
Белый
рыхлый
каллус
(рис.
а)
состоял
из
дедифференцированных паренхимных клеток с большой
центральной вакуолью.

58.

Рис. Плотноглобулярный
каллус F. еsculentum:
2. Плотноглобулярный белый или желтоватый, медленно
нарастающий каллус представлен плотно сцепленными
между собой глобулами, состоящими из массы крупных
вакуолизированных клеток, покрытых сверху обширными
слоями мелких меристематических клеток. В промежутках
между глобулами находились крупные паренхимные, слабо
связанные друг с другом клетки.

59.

Рис. Гетерогенный каллус F. еsculentum
3. Гетерогенный каллус, состоящий из рыхлых глобул
серого, желтого или светло-коричневого цвета, в
большинстве случаев медленно нарастающий.

60.

Рис. Плотный каллус F. еsculentum:
Плотный бело-серый, медленно нарастающий каллус.
Каллусная
ткань
была
представлена
плотно
прилегающими друг к другу паренхимными клетками.

61.

Рис. Глобулярный каллус F. еsculentum:
Глобулярный, распадающийся при культивировании на
отдельные, не связанные между собой глобулы.
В глобулярных каллусах меристематические зоны
расположены в центре отдельной глобулы и окружены
сверху обкладкой из паренхимных клеток.

62.

• Имеется
связь морфологии каллусов
способностью к регенерации растений.
• Каллусы
с
высоким
потенциалом обычно:
матовые,
компактные,
с
их
морфогенетическим
• структурированные,
• имеют зеленые хлорофиллсодержащие участки,
которые представляют собой зоны морфогенеза.
Впоследствии там формируются
растения-регенеранты.
побеги
или

63.

64.

• Техника
культивирования
тканей
растений
позволяет
получить
длительную, пересадочную каллусную
культуру из любых живых клеток
растения.

65.

• Изменения
в
морфологии
могут
наблюдаться в процессе длительного
культивирования каллусов.

66.

Как правило, в длительной культуре
на средах, содержащих ауксины,
каллусные ткани теряют пигментацию и
становятся рыхлыми.
Такие каллусы либо совсем не
способны
к
органогенезу,
либо
формируют только корни.

67.

• Неморфогенные каллусы могут быть
переведены в суспензионную культуру
для получения вторичных метаболитов.

68.

Каллусная клетка имеет свой цикл
развития и повторяет развитие любой
клетки:
• включая деление
• растяжение
• дифференцировку
после
чего
наступает старение и отмирание
клетки.
Каллусную дифференцировку можно
назвать вторичной.

69.

Чтобы не произошло старения, утраты
способности к делению и отмирания
каллусных
клеток,
первичный
каллус,
возникающий на эксплантах, через 4—6
недель переносят на свежую питательную
среду (субкультивируют).
Эту операцию называют пассированием.
При
регулярном
пассировании
или
субкультивировании
каллусной
ткани
способность
к
делению
может
поддерживаться в течение десятков лет.

70.

Размер трансплантанта (переносимого
кусочка) при культивировании на
агаризованной
питательной
среде
обычно колеблется от 60 до 100 мг
массы ткани на 30—40 мл питательной
среды.

71.

Каллусные клетки в пересадочной
культуре спонтанно могут приобрести
гормоннезависимость.

72. ГОРМОНОНЕЗАВИСИМЫЕ РАСТИТЕЛЬНЫЕ ТКАНИ

«Привыкшие» клетки, или химические опухоли каллусные клетки автономные по отношению к
ауксинам и цитокининам.
Возникают
при длительном культивировании
каллусной ткани
Не способны к нормальной регенерации и образуют
лишь тератомы
• Гормононезависимость достигается в результате
изменения активности генов, отвечающих за синтез
ферментных белков, участвующих в построении
молекул гормонов, следовательно, отвечающих за
синтез гормонов.

73.

Опухоли
растительного
происхождения,
вызванные
бактериями,
вирусами
корончатые галлы-опухоли, индуцированные
у двудольных растений агробактериями
(Аgrobaсterium tumifaziens)
Генетические опухоли, возникающие на
межвидовых гибридах различных растений.

74. Генетика каллусных клеток

• Генетически стабильными in vitro являются
меристематические ткани.
• Клетки
каллусной
выраженной
гетерогенностью
каллусных клеток)
ткани
обладают
генетической
(неоднородность

75. Генетика каллусных клеток

Выражается генетическая гетерогенность
в различной плоидности
в анеуплоидии
В каллусных клетках табака через четыре года
культивирования совсем не остается диплоидных
клеток: все клетки становятся полиплоидными или
анеуплоидными.
Причины:
• условий культивирования и прежде всего
входящих в состав питательной среды веществ.
• Полиплоидные клетки имеют меньшую лаг-фазу
и поэтому быстрее переходят к делениям, чем
диплоидные.
• обе причины.

76.

• Культивирование клеток in vitro приводит к
значительным гормональным нарушениям и
увеличению геномной изменчивости, которая
выражается в полиплоидизации клеток.
• Через
2
года
культивирования
все
морфотипы каллусов гречихи культурной
были миксоплоидными. Плоидность клеток
находилась в пределах от n до 5n.

77.

Было показано, что у гороха первичный
каллус состоял из диплоидных клеток.
Через
3
недели
культивирования
появлялись клетки с 3n, 4n, 6n и 8n набором
хромосом.
Но к 18 неделе уровень плоидности клеток,
составляющих каллус, опять возвращался к
2n.
По мнению Мо (1989) в клетках каллусных культур может
существовать
система
элиминации
хромосом,
поддерживающая диплоидный уровень.

78.

хромосомных абберациях
генные
мутации
выявляются
по
изменению морфологии и физиологобиохимических свойств клеток.

79.

Причины генетической
культивируемых клеток
нестабильности
генетическая
неоднородность
исходного
материала (гетерогенность экспланта).
нарушение
коррелятивных
связей
при
выделении экспланта.
длительное
пассирование
тканевых
и
клеточных культур
влиянием на генетический аппарат клетки
входящих
в
состав
питательных
сред
фитогормонов,
необходимых
для
каллусообразования, — ауксины, цитокинины.

80.

Генетическое
разнообразие
каллусных
клеток
позволяет
использовать их для клеточной
селекции
на
устойчивость
к
неблагоприятным факторам среды,
фитопатогенам и на повышенную
продуктивность.