Культура клеток, тканей и органов растений. Введение в предмет

1.

КУЛЬТУРА КЛЕТОК,
ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ
РАСТЕНИЙ
Лекция 1
ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ

2.

ПЛАН ЛЕКЦИИ
1.
Предмет культуры клеток, тканей и
органов растений. Тотипотентность
растительной клетки.
2.
Значение метода культуры клеток, тканей
и органов растений для решения
фундаментальных проблем биологии.
3.
Культуры клеток и тканей как основа
биотехнологии растений.
4.
История развития метода культивирования
клеток, тканей и органов растений.

3.

Метод культуры клеток, тканей и
органов растений - выращивание либо
поддержание в жизнеспособном
состоянии изолированных клеток,
различных тканей и органов растений в
асептических условиях на искусственных
питательных средах

4.

Принципы
культивирования
клеток

5.

Главное требование –
соблюдение строгой асептики

6.

Второе условие –
использование специальных
питательных сред

7.

Третье условие –
проведение регулярных пересадок
культур на свежие питательные среды

8.

Варианты растительных объектов,
культивируемых in vitro
Культура клеток, тканей и органов
растений
Изолированные
зародыши
Изолированные
органы
Каллусная
культура
Культура
протопластов
Суспензионная
культура

9.

Способы культивирования
растительных клеток
Поверхностное
культивирование на
плотной (агаризованной)
питательной среде
Глубинное
культивирование в
жидкой питательной
среде
Каллусные
культуры
Суспензионные
культуры

10.

Каллусная ткань – ткань, возникающая
путем неорганизованной пролиферации
клеток экспланта и выращиваемая
поверхностным способом на полутвердой
агаризованной питательной среде

11.

Каллус (от лат. callus — толстая кожа, мозоль)

12.

Каллус может образоваться не только в искусственных
условиях, но и в природе, например, на раневой поверхности.
Каллусная ткань способствует зарастанию ран, срастанию
прививок и служит для регенерации утраченных органов

13.

Суспензионная культура – отдельные клетки
или клеточные агрегаты, выращиваемые в
жидкой питательной среде во взвешенном
состоянии

14.

Необходимое условие для поддержания
суспензионных культур –
постоянное перемешивание питательной
среды

15.

В основе метода культуры клеток и тканей
растений лежит уникальное свойство
растительной клетки – тотипотентность

16.

Терминальная дифференцировка – необратимый
процесс, после которого клетка не может
дедифференцироваться и реализовать свою
тотипотентность
Характерна для:
•мертвых клеток ксилемы;
•клеток ситовидных элементов, не имеющих ядра;
•клеток механических волокон

17. Культура клеток и тканей растений

Биологическая система
(экспериментально созданная популяция
соматических клеток)
Модель
(для решения фундаментальных проблем
физиологии, биохимии и генетики
растений)
Инструмент
(основа биотехнологии растений)

18.

Преимущества культуры клеток и тканей как
экспериментальной системы для решения
фундаментальных и прикладных задач биологии:
•отсутствие коррелятивных взаимодействий и контроля
со стороны других тканей, органов, целого организма,
что позволяет проследить состояние клетки на уровне
первичных элементарных процессов в ответ на любые
воздействия;
•возможность быстро получать достаточную массу в
асептических условиях;
•контролируемые по многим параметрам условия
выращивания.

19.

Особенности популяций растительных клеток,
культивируемых in vitro:
•генетические;
•эпигенетические;
•морфологические;
•физиолого-биохимические.

20.

Направления использования культуры клеток и тканей для
решения теоретических вопросов физиологии, биохимии и
генетики растений
Клетки и ткани растений
in vitro
Изучение вторичного
метаболизма и его
регуляции
Механизмы
опухолеобразования
Процессы
цитодифференцировки и
морфогенеза
Генетика соматических
клеток
Механизмы устойчивости
растений к неблагоприятным
факторам среды

21.

Биотехнологии на основе культивируемых клеток,
тканей и органов растений
Культура клеток, тканей и
органов растений
Получение
экономически ценных
БАВ
Ускорение
селекционного
процесса
Клональное
размножение растений
Генетическое
улучшение растений
Получение
оздоровленных
растений
Сохранение
генофонда редких
видов

22.

1. Получение экономически ценных биологически активных
веществ
- производство лекарственных
препаратов;
- получение пищевых добавок,
красителей;
- производство косметических
средств и др.

23.

Япония, 1983 г. – коммерческое получение шиконина
с помощью суспензионной культуры воробейника
краснокорневого в биореакторе вместимостью 750 л.
Биотехнологический способ
получения шиконина
дешевле, стабильнее, не
зависит от импорта и
других внешний условий.
Содержание производных
шиконина в культуре клеток
достигает 12,6 % от сухой
массы клеток.

24.

России принадлежит приоритет промышленного
получения биомассы культуры клеток
В конце 70-х гг. XIX в. на ряде заводов
Главмикробиопрома было организовано
производство биомассы культуры
клеток женьшеня. На ее основе
созданы медицинские препараты
(настойка «Биоженьшень») и
косметические средства (шампунь
«Диона», лосьон «Женьшеневый» и др.)

25.

Получение противоопухолевого препарата
таксола на основе культуры клеток тиса (Taxus sp.)
– фирма Phyton Biotech

26.

Phyton Biotech является одним из пионеров
коммерческого применения культур растительных клеток.
Основав производство в 1990 г., в 1993 г. фирма приобрела
производственную базу в Германии, ставшую крупнейшим
заводом в мире с биореакторами до 75 тысяч литров.
В 2009 г. у Phyton Biotech появилось производство в Канаде.
В настоящее время Phyton Biotech является крупнейшим
производителем паклитаксела (Таксола), для полусинтеза
которого в культуре тканей растений ими производится
10-деацетилбаккатин III.

27.

https://phytonbiotech.com/about-pcf/

28.

Корейская компания CBNBiotech
специализируется на культивировании адвентивных корней
женьшеня

29.

30.

Производство косметических средств

31.

32.

СitrustemTM — Стволовые клетки
Инновационный
коктейль для
эффективного
омолаживающего
ухода. Содержит
высокую концентрацию
растительных
стволовых клеток,
фактора
самообновления
эпидермальных
стволовых клеток
и натуральных олигои полисахаридов,
которые действуют
на клеточном
и молекулярном
уровнях, стимулируя
естественные
процессы обновления
кожи.

33.

Активные ингредиенты:
Экстракт культуры стволовых
клеток швейцарского яблока
PhytoCellTec Malus Domestica
(Швейцария) в количестве 2%
Трипептид с уникальной
последовательностью аминокислот
Syn-Coll (Швейцария)
Витамин Е
Масло виноградной косточки
Экстракт цветков апельсина

34.

Состав: вода, сквалан, экстракт культуры
недифференцированных клеток Leontopodium
Alpinum (эдельвейса), ксантановая камедь,
гидролизованный экстракт клубня Manihot
Esculenta (маниока), гидроксиэтилмочевина, бисПЭГ-18 метиловый эфир диметилсилана, экстракт
семян Pyrus Malus (яблок), карбомер, полисорбат20, пальмитоилолигопептид,
пальмитоилтетрапептид-7, кроссполимер
диметикона/винилдиметикона, диоксид кремния,
бутиленгликоль, экстракт Euphrasia Officinalis
(очанки), экстракт листьев Melissa Officinalis
(мелиссы), экстракт бутонов/цветов Magnolia
Biondii (магнолии), лецитин, феноксиэтанол,
метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен,
полиакрилат натрия, гидрогенизированный
полидецен, тридецет-6, трометамин,
кроссполимер акрилатов и C10-C30
алкилакрилата, парфюмерная композиция, 2бром-2-нитропропан-1,3-диол, гидрохлорид
аргинина

35.

В 2008 г. установлено, что экстракт каллуса яблок сорта Uttwiler
Spatlauber увеличивает пролиферативную активность стволовых
клеток человека, выделенных из пуповинной крови, а также
на генетическом уровне восстанавливает уменьшающуюся
с возрастом активность фибробластов .

36.

37.

38.

39.

2. Клональное размножение растений
Преимущества микроклонального
размножения в сравнении с
традиционными методами:
•высокие коэффициенты размножения;
•миниатюризация процесса, приводящая к экономии
площадей, занимаемых маточными и размножаемыми
растениями;
•в условиях in vitro часто размножаются и укореняются
те растения, которые совсем не размножаются
обычными способами.

40.

Впервые этот метод применил французский исследователь
Ж. Морель в 1960 г. для размножения орхидей (Cymbidium).
Из апикальной меристемы исходного растения ему удалось
в течение года получить около четырех миллионов новых
растений

41.

Технология клонального размножения растений
сегодня является основой функционирования
коммерческих предприятий во многих странах
мира
В США около
100 предприятий
получают
посадочный
материал
декоративных,
овощных,
полевых,
плодовых и
лесных культур
методом
клонального
размножения.

42.

Во Франции 94% всей
продукции цветочных
культур получают
методом культуры
изолированных клеток и
тканей

43.

3. Получение оздоровленных растений
Клональное микроразмножение приводит к оздоровлению
получаемых растений от нематод, грибных и
бактериальных патогенов.
Для оздоровления
посадочного материала от
вирусов, вироидов и
микоплазм используют
метод культуры меристем.

44.

4. Ускорение селекционного процесса на основе клеточной
инженерии
Гибридизация
соматических клеток
Введение органелл в
протопласт

45.

5. Генетическое улучшение растений
Наиболее важные проблемы, для решения
которых осуществляется генетическая
трансформация растений:
•повышение устойчивости к биотическим и
абиотическим стрессам;
•улучшение качества запасных белков
зерна;
•повышение эффективности
азотфиксации и расширение круга
культурных растений, способных к
симбиотической фиксации азота.

46.

Самые распространенные трансгенные растения
1 место (51% площадей)
2 место (31%)
3 место (13%)
4 место (5%)
Соя
Обогнала по
захваченной
площади свой
«традиционный»
аналог
Кукуруза
Хлопок
Рапс

47.

Рейтинг коммерциализированных
трансгенных растений:
гербицидоустойчивые культуры ;
культуры, устойчивые к насекомым-вредителям;
комбинированные культуры (оба этих признака)

48.

6. Сохранение генофонда редких видов
Варианты сохранения генофонда растений на
основе метода культуры клеток и тканей:
•пересадочные коллекции – культивирование in vitro
изолированных органов, тканей и клеток растений с
использованием частых пересадок;
•депонирование коллекций – сохранение коллекций без
частых пересадок путем их экспозиции при пониженных
температурах, либо в присутствии консервантов;
•криосохранение – способ хранения
объектов в жидком азоте при
температуре -196°С.

49.

Области применения культуры клеток, тканей и
органов растений
Культура клеток, тканей и органов
растений
Промышленная
биотехнология
Сельскохозяйственная
биотехнология
Экология
Производство БАВ для
медицины, ветеринарии,
косметики, пищевой
промышленности
Растениеводство
Сохранение генофонда
редких и исчезающих
видов, биоскрининг
химических соединений
Ускорение и облегчение
селекционного процесса
Размножение и
оздоровление растений
Генетическое улучшение
растений

50.

История развития метода
культивирования клеток,
тканей и органов растений
Метод культуры клеток и тканей растений
был разработан около 80 лет назад – в
первой половине прошлого столетия

51.

I ЭТАП (1878-1902)
Фехтинг,
1878
Выявил наличие полярности у
изолированных фрагментов стеблей.
Сделал вывод, что полярность
свойственна не только органам, но и
каждой клетке растения
Б
Hermann Vöchting
А
Образование корней у черенков ивы

52.

I ЭТАП (1878-1902)
Рехингер,
1893
Karl Rechinger
Определил минимальные размеры
эксплантов для регенерации целых
растений

53.

I ЭТАП (1878-1902)
Габерландт,
1902
Gottlieb Haberlandt
Впервые четко сформулировал принципы
культивирования клеток и тканей
(использование питательных сред и
соблюдение асептических условий)
Выдвинул гипотезу о тотипотентности
любой живой клетки растений.
Однако не смог получить ее
экспериментальные доказательства.
Причина – использование в качестве
объектов исследования
высокоспециализированных клеток
(например, замыкающие
клетки устьиц, железистые
волоски и др.)

54.

II ЭТАП (1902-1922) – попытки культивирования
растительных эксплантов на питательных средах
природного происхождения
Гаррисон, 1907;
Каррель, 1911
Ross Harrison
Aleksis Carrel
Разработали методику
выращивания тканей
животных на питательных
средах природного
происхождения (плазма
крови, зародышевая
жидкость, лимфа).
Попытки культивирования
растительных клеток в
аналогичных условиях
оказались неудачными.

55.

III ЭТАП (1922-1932) - разработка метода
культуры корневых меристем
Котте,
Роббинс, 1922
American Robbins
German Kotte
Постулировали
необходимость
использования для
культивирования
меристематических
клеток, а также
применения более
сложных по составу
культуральных сред
Их работы - начало
развития метода
изолированных корней
растений

56.

IV ЭТАП (1932-1940) – начало успешного развития
метода культуры клеток и тканей растений
Уайт,
1934;
Готре,
1935
Philip White
Родоначальники современных методов
культивирования изолированных тканей и
органов растений.
Заслуги Уайта:
- показал, что корневая меристема может
расти неограниченно во времени, если
ее пересаживать на свежую
питательную среду;
- усовершенствовал состав питательной
среды для культивирования
растительных клеток;
- показал способность к неограниченному
росту растительных опухолей

57.

Заслуги Готре:
Roger Gautheret
- ввел в культуру новые объекты –
каллусные ткани древесных
растений камбиального
происхождения и каллусные
ткани запасающей паренхимы;
- предложил ввести в состав
питательной среды фитогормон
ауксин;
- заменил жидкую питательную
среду на твердую –
агаризованную
Успех работ Уайта и Готре во многом был определен
оптимальным сочетанием объектов культивирования и
состава питательных сред

58.

V ЭТАП (1940-1960)
Ученики и
последователи
Готре и
Уайта
Увеличивается число видов
растений, ткани которых
культивируются
in vitro.
Разработаны составы ряда
питательных сред, что позволило
получать длительные
пересадочные культуры из
разных органов и тканей
растений

59.

V ЭТАП (1940-1960)
Скуг, Миллер, 1955
Folke Skoog
Carlos Miller
Открыли новый класс
стимуляторов роста
растений –
цитокинины. Показали
их значение для
пролиферации клеток
in vitro
Miller and Skoog demonstrate that the ration of auxin:cytokinin
http://labs.bio.unc.edu/
alters organogenesis in vitro

60.

VI ЭТАП (1960-1975)
Кокинг, 1960
Edward C. Cocking
Разработал ферментативный
метод получения
протопластов

61.

VI ЭТАП (1960-1975)
Такебе, 1971
Разработал метод гибридизации
растительных клеток путем
слияния изолированных
протопластов с помощью ПЭГ

62.

VI ЭТАП (1960-1975)
Mopeль, 1959
Бутенко, 1960
Разработка методов
микроклонального размножения
растений

63.

64.

Является основоположником школы
биологии растительной клетки в России.
Впервые в СССР широко и систематически
развернула работы по культуре тканей,
клеток и протопластов растений.
Раиса
Георгиевна
Бутенко
13.09.1920 –
26.03.2004
Одна из первых осуществила регенерацию
целого растения из отдельной
изолированной клетки. Под ее
руководством созданы Всероссийская
коллекция клеточных культур и Криобанк
растительных объектов.
Биология клеток высших растений
in vitro и биотехнологии на их основе:
Учеб. пособие / МГУ им. М.В.
Ломоносова. — М.: ФБК-Пресс, 1999.
— 159 с.

65.

А. М. Носов, доктор биологических наук,
зав. кафедрой физиологии растений МГУ
«Культура клеток высших растений: от теории к
практике»
В истории науки известно немало примеров, когда открытия, казавшиеся
чистой игрой ума и не имевшие, на первый взгляд, никакого практического
значения, впоследствии приводили к революционным изменениям в
промышленности или сельском хозяйстве. Сказанное можно отнести к
изолированным клеткам растений.
Директор Института физиологии растений, академик А. Л. Курсанов
вернулся с Ботанического конгресса, который проходил в середине 50-х
годов в Париже. Р. Г. Бутенко в то время была ученым секретарем
Института. Андрей Львович в беседе с ней как-то упомянул: «В Париже
выращивают на питательных средах кусочки тканей растений». На
естественный вопрос Раисы Георгиевны «зачем?» он ответил: «Не знаю, но
красиво. Не хотите ли попробовать?» С этого разговора в нашей стране
начались пионерские работы по культуре клеток высших растений,
которые через полвека превратились в важнейшее направление
современной физиологии растений и биотехнологии. Можно утверждать,
что представление о культуре клеток высших растений как об уникальной
экспериментально созданной биологической системе возникло во многом
благодаря трудам Р. Г. Бутенко и ее сотрудников.

66.

VI ЭТАП (1960-1975)
Гуха,
Магешвари, 1964
S. Maheswari
Разработка методов
андрогенеза и
гиногенеза

67.

VI ЭТАП (1960-1975)
Вэсил,
Хильдебрандт, 1965
V. Vasil
A. Hildebrandt
Экспериментальное
доказательство
тотипотентности
соматических клеток
растений
Science. 1965 Mar 19;147(3664):1454-5.
Growth and Tissue Formation from Single,
Isolated Tobacco Cells in Microculture
Science. 1965 Nov 12;150(3698):889-92.
Differentiation of Tobacco Plants from
Single, Isolated Cells in Microcultures.
Vasil V, Hildebrandt AC.

68.

VII ЭТАП (1975-настоящее время)
Этот период характеризуется быстрым развитием
техники in vitro, изучением биологии культивируемых
растительных объектов и созданием биотехнологий
на их основе (получение новых форм и сортов
сельскохозяйственных растений на основе клеточной
и генной инженерии, масштабное получение
оздоровленного посадочного материала, сохранение
генофонда редких и исчезающих видов и т.д.)