Биотехнология растений. Клеточная селекция

1.

Биотехнология растений

2.

Лекция 2. Клеточная селекция
I.Основные принципы и этапы клеточной
селекции
II.Методы клеточной селекции
III.Позитивная (прямая) клеточная селекция
IV.Опосредованная клеточная селекция
V.Негативная клеточная селекция

3.

Принципы клеточной селекции
Мутагенез (радиоционный, химический)
Исходный эксплант
.
Отбор на уровне
клеток
Культура
Суспензионная
протопластов
культура
Каллусная
культура
.
Отбор мутантов
.
Регенерация
растения
.
Мутантное растение
.
Ретестирование
in vitro
Отбор на
уровне
целых
растений
Генетический анализ Тестирование нового
(R1, R2)
генотипа

4.

Мутагенез in vitro
Основные мутагены, используемые в клеточной селекции и некоторые
аспекты их применения
Химические
Физические
1. Этилметансульфонат (ЭМС)
1. γ-излучение. Используется для
получения ауксотрофов, мутантов
2. N-метил-N-нитро-Nустойчивости к гербицидам и
нитрозогуанидин (НГ).
валину
Применяется для получения
2. УФ-излучение. Хорошо
мутантов устойчивости к
зарекомендовала себя при
аналогам аминокислот, к аналогам
получении некоторых ауксотрофов
нуклеиновых кислот; для
и мутантов устойчивости к
получения некоторых ауксотрофов
валину
3. N-этил-N-нитрозомочевина
3. Рентгеновское излучение.
(НЭМ). Используется для
Применяется для получения
получения мутантов
пигменто-дефектных мутантов
устойчивости к хлорату, аналогам
аминокислот; для получения
мутантов, дефектных по
нитроредуктазе

5.

Получение протопластов
или
проросток
лист
Клеточная
стенкацитоплазма
Раствор, содержащий
вакуоль
целлюлазу, сахар и
ядро
соли
Плазматическая
мембрана
протопласты
Колония
Фильтровальная протопластов
бумага
Обломки клеточных
стенок
Питательная
среда
побегообразование
Клетки-няньки
впаены в среду
Среда с высоким
содержанием
цитокининов и низким ауксинов
Растение-регенерант
Среда без цитокининов и низким
содержанием ауксинов

6.

Позитивная клеточная селекция
Растение
дикого типа
Отбор на
устойчивость к
селективному
агенту на уровне
микрокаллуса
Биотест с
фитофторой
Индукция
каллусогенеза
Селекция
устойчивых
форм
Регенерация

7.

Примеры позитивной клеточной селекции
1а.Устойчивость к селективному агенту на уровне:
Устойчивость на уровне
растения
Трансгенные
растения
Устойчивость на клеточном
уровне
wt
MS0
MS0 MS0+Km
MS0+Km
Nicotiana tabacum
MS0+нистатин (сублетальная
концентрация)
Протопласты картофеля

8.

1б.Устойчивость к полиеновым антибиотикам
A. Каллусы табака на среде не содержащей селективный агент;
Б. Каллусы табака на среде, содержащей летальную концентрацию
нистатина;
B. Каллусы табака на
концентрацию нистатина.
среде
содержащей
сублетальную

9.

Устойчивость к аминокислотам и их аналогам
Биосинтез аминокислот, производных аспартата
Аспартат
AK
Β-аспартилфосфат
Аспарагиновый β-полуальдегид
DHDPS
Гомосерин
Треонин
Изолейцин
2,3-дигидропиколинат
Метионин
Лизин
AK - аспартаткиназа;
DHDPS - синтаза дигидропиколиновой кислоты

10.

Опосредованная клеточная селекция
Получение растений, устойчивых к насекомым и грибам
Растение
дикого типа
Отбор на
устойчивость к
полиеновым
антибиотикам на
уровне микрокаллуса
Индукция
каллусогенеза
Регенерация

11.

Гидрофильный слой
Гидрофобный слой
Холестерол
Кампестерол
Ситостерол
Основные
стерины
Стигмастерол
Фосфотидилэтаноламин
Фосфотидилхолин
Расположение в
мембране
Холестерол

12.

Вещества, изменяющие состав
стеринов
Нистатин
O
CH3
O
OH
CH3
OH
CH3
O
OH
OH
OH
OH
OH
O
CH3
OH
OH
Полиеновый антибиотик
Образует комплексы со стеролами в
клеточной
мембране;
приводит
к
изменению проницаемости мембраны и
возможной гибели клетки
Фунгицид
Состав: 25% тридименола
3% фуберидазола
NH2
COOH
O
OH
Ингибиторцитохром
P-450-зависимой
монооксигеназы, которая удаляет С-14α
метильную группу в процессе стерольного
биосинтеза; приводит к накоплению С14α метилстеролов
Cl
O
CH
OH
CH3
CH
C
CH3
N
N
OH
OH
CH3
OH
OH
O OH OH
CH3
O
OH
CH3
Филлипин
OH
Полиеновый антибиотик
Состав: филлипин III
смесь 4х макролидов
OH Связывает стерины с образованием
крупных плоских агрегатов между
бислоями, что приводит к разрушению
мембраны;
комплексфиллипин-стерин
локализуется в верхнем билипидном слое
и вызывает деформацию мембраны
N
Байтан
CH3

13.

Получение растений с измененным
содержанием стеринов
Спектр
растения
дикого типа
Спектр 13/5
растения
Процесс регенерации
Спектры основных стеролов:
Растение-регенерант (табак)
1. Холестерол, 2. Кампестерол,
3. Стигмастерол, 4. Ситостерол,
5. 24-метилен циклоартенол,
6. Циклоартенол, 7. D7-кампестерол,
8. D7-ситостерол, D7-авенастерол,
10. 24-этилдиен лофенол

14.

Модель табак- дрозофила
Растение
Каллус
Диаграмма фертильности Drosophilla на среде содержащей гомогенат
нистатин -устойчивых растений табака

15.

Модель табак- дрозофила
Развитие яичников Drosophilla в норме (слева) и при стерольной диете
(справа)

16.

Модель картофель - фитофтора
Устойчивые к P. infestans растения картофеля линии Rf18
Биотест in vitro:
2-5 растения с различным уровнем
чувствительности
Устойчивые
растения
Биотест in vivo
Контроль

17.

Пропорция основных стеролов в листьях
исходного сорта Пушкинец-1 и
устойчивого к фитофторозу (Rf18)
растения картофеля (количество
холестерола принято за 1)
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Пушкинец-1
Pushkinetz-1
Холестерол
cholesterol
Ситостерол
sitosterol
Rf18
Rf18
plant
Растение
Кампестерол
campesterol

18.

Фенотип “dwarf” растений картофеля,
устойчивых к филлипину
“Dwarf” растение картофеля
линии Rb3 (слева) и растение
дикого типа (справа)
Цветки Rb3 растения (в
середине) и цветки растения
дикого типа (по бокам)

19.

Молекулярно-генетические механизмы
устойчивости растений к вредителям
сельского хозяйства
Типы устойчивости:
1) Видовая
устойчивость
(иммунитет)
–
устойчивость к подавляющему числу патогенов
2) Сортоспецифическая устойчивость –
поражаются отдельные сорта (генетипы)
не

20.

Мучнистая роса
Разнообразие патогенов
Крапчатый вилт
Антракноз
Корневая нематода
Бактериальная сыпь
Вирус мозаики томата
Fusarium вилт
Корончатый галл

21.

Botrytis cinerea, возбудитель серой гнили,
споруляция на винограде

22.

Методы биотехнологии и получения устойчивых
растений
Трансгенный подход
Клеточная селекция
Растение
дикого типа
Отбор на
устойчивость к
селективному агенту
(токсин) на уровне
микрокаллуса
Индукция
каллусогенеза
Маркерная
линия
Регенерация
Получение
устойчивой линии
требует несколько
поколений бэкроссов

23.

Негативная клеточная селекция

24.

Частота возникновения ауксотрофных
клонов у N. plumbaginifolia
Доза, *
гр
13
Число (частота)
Выживаемость, **
%
тестируемых ауксотрофов
клонов
57
3727
0
16
23
3705
0
19
15
2377
0
23
11
4420
3(8•10-3)
* γ-лучи (60Со-пушка, 0,042 гр/с)
** эффективность высева необлученных протопластов 70%

25. Соматическая гибридизация

26.

Соматическая гибридизация – способ
получения соматических гибридов в
результате слияния протопластов разных
видов ( ФОРМ).

27. Техника получения соматических гибридов.

•1.Изоляция протопластов
•2. Слияние протопластв различных форм.
•3. Идентификация и селекция соматических гибридных клеток.
•4.Культивирование гибридных клеток.
•5. Регенерация гибридных растений

28.

•Методы изоляции протопластов из растительных тканей.)
1. Механический метод
2. Энзиматичекий метод

29. 1. Механический метод

Ткани растений
Надрезы клеточной стенки
Плазмолиз
Выход протопластов
Отбор протопластов

30. Идентификация и селекция соматических гибридов

• идентификация гибридов основана на
различиях между родительскими и
гибридными клетками
• пигментация
• цитоплазматические
маркеры
(наличиеотсутствие хлоропластов)
• использование ауксотрофных мутантов
• .физиологические
различия
родительских
клеток

31.

селекция гибридных клеток
(используемые маркеры )
• генетическая комплементация
• гормонезависимость по гормонам
• ауксотрофные мутанты и мутанты по
метаболизму
• анализ хромосом

32.

33.

34.

•Identification of the somatic hybrids using RAPD analysis
1 2
M
h h h h h

35.

• изучение генов цитоплазматических
детерминант
• анализ групп сцепления хлоропластов и
митохондрий
• получение уникальных гибридов с
разным сочетанием ядерных генов и
генов цитоплазматических детерминант

36.

37.

38.

•Genome composition of the BC2 hybrid (AAAE)
•determined by using GISH analysis
•4х=(39 potato chromosomes) and (12 S.etuberosum chromosomes)
•BC2 hybrid derived from the sexual crosses of potato and
•interspecific somatic hybrid
• Solanum tuberosum (genome A) (+) S.etuberosum (genome E)

39.

PVY-infected potato plants ( ) and resistant ( )
field growing somatic hybrids
Solanum tuberosum (+) Solanum etuberosum

40.

41. использование соматических гибридов

• получение новых межвидовых гибридов
– Pomato (гибрид картофеля и томата)
• получение
фертильных
диплоидов
и
полиплоидов
от
стерильных
гаплоидов,триплоидов и анеуплоидов
• перенос
генов
интереса,например,
устойчивости от дикорастущих форм к
культурным