Оптические методы количественного анализа

1. Оптические методы количественного анализа

2.

Оптический количественный
анализ основан на регистрации
изменений, происходящих с лучом
света при прохождении его через
исследуемый раствор.
Методы количественного анализа:
Фотометрия
Рефрактометрия
Поляриметрия

3. Фотометрические методы анализа

1.
Абсорбционная фотометрия:
Спектрофотометрия
Нефелометрия
Атомно-абсорбционная фотометрия
2. Эмиссионная фотометрия:
Флюориметрию
Пламенную фотометрию
Атомно-эмиссионный спектральный анализ

4.

Спектрофотометрия
Измерение интенсивности окраски раствора
анализируемого вещества относительно интенсивности
окраски эталонового раствора.
Приборы для выполнения - фотометры и
спектрофотометры.
В фотометрах нужные спектральные диапазоны
выделяются при помощи светофильтров. Число рабочих
участков спектра = числу светофильтров.
В спектрофотометрах участки света выделяются с
помощью призм или дифракционных решеток, поэтому
можно установить любую длину волны в заданном
диапазоне и выделить более узкий (монохроматический)
участок спектра.
Спектрофотометры –приборы более высокого класса.

5.

6. Нефелометрия

Нефелометрия основана на феномене
рассеивания света, когда падающий луч ударяется
в частицу или комплекс антиген — антитело в
растворе. В результате этого количество
рассеянного света пропорционально количеству
антигена.
Нефелометрию типично используют для
определения уровня специфических белков,
которые, связываясь с антителами, образуют
крестообразные частицы в растворе.
Под нефелометры обычно специализированы
отдельные анализаторы, имеющие ограниченное
меню тестов, поскольку принцип рассеивания
света применим только для молекул размером не
больше 40 нм.

7.

8. Нефелометрия-измерение рассеянного света

9. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ

АВТОМАТИЧЕСКИЙ
НЕФЕЛОМЕТР « BNProSpec» Преимущества автоматической нефелометрии
ОДИНОЧНЫЙ АНАЛИЗ
ВЫСОКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
ВЫСОКАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ (ОСОБЕННО
ВАЖНО ОКОЛО «НУЛЯ», НЕТ ЛОЖНЫХ
ЗНАЧЕНИЙ)
ВЫСОКИЙ ДИНАМИЧЕСКИЙ ДИАПАЗОН

10.

Нефелометрия-измерение рассеянного
света. Если известны размеры частиц ,
то интенсивность рассеянного света
при фиксированном угле измерения
будет пропорциональна концентрации
вещества. Приборы для нефелометрии
программируются под измерение
определенных компонентов
биологической жидкости.

11.

12. Эмиссионная фотометрия

Это метод анализа, основанный на
измерении энергии, излучаемой веществом в
результате энергетически возбужденного
состояния.
Основные методы эмиссионной
фотометрии:
а) Флуориметрия
б) Пламенная фотометрия

13. ФЛУОРИМЕТРИЯ

Флуориметрия – основана на измерении
флуоресценции, которая возникает в результате
энергетического возбуждения исследуемого вещества
под влиянием жесткого коротковолнового облучения
(обычно ультрафиолетовые лучи).
Выполняется на аппаратах – флуориметрах.
По чувствительности намного выше
колориметрических методов (в 100-1000раз).
Недостаток – связан именно с высокой
чувствительностью, т.к. требуются громоздкие
способы предварительной очистки вещества от
примесей, которые вносят фоновые искажения.
В клинических лабораториях используется нешироко.
Определяют катехоламины.

14. Пламенная фотометрия

В качестве энергетического агента, вызывающего
состояние возбуждения исследуемого вещества
используется пламя газовой горелки.
Ионы металлов окрашивают пламя в различный цвет, в
соответствии с характерными для них спектрами
испускания. Для выделения излучения отдельных
ионов применяют специальные светофильтры.
В КДЛ применяют в основном для определения
концентрации ионов калия и натрия, т.к. эти элементы
возбуждаются легче остальных - достаточна энергия
низкотемпературного пламени сгорания метана в
воздухе.
Недостаток метода – необходимость газового
оборудования. Эти методы заменяют на
ионоселективные, потенциометрические.

15. Рефрактометрия

Метод основан на измерении
показателя преломления света при
прохождении его
через оптически неоднородные среды.
Пример – определение общего белка в
сыворотке. В лаборатории
используется мало.

16. Поляриметрия

Основан на способности веществ в
растворе изменять плоскость
поляризованного луча света.
Пример – лазерный поляриметр для
определения глюкозы в моче. В КЛД
применяется мало.

17. Фотометрия в современной лаборатории

18. Измерения по «конечной точке»

Кривая реакции
Калибровочный график
(изменение оптической плотности
в зависимости от времени)
(зависимость оптической плотности
от концентрации)
А (опт. плотн.)
А (опт. плотн.)
А обр.2
А кон.
А кал.
∆А
А обр.1
А реаг.
А нач.
Т0
Тn
Т (время)
С обр.1 С обр.1 С кал.
С обр.2 С обр.2 С (конц.)
А обр. - А реаг.
С обр. = ———————— х С кал.
А кал.. - А реаг.

19. Кинетические измерения

Кривая реакции
Кривая реакции
(увеличение оптической плотности
в зависимости от времени)
(уменьшение оптической плотности
в зависимости от времени)
А (опт. плотн.)
А (опт. плотн.)
t = 37° C
25° → 37° C
t = 25° C
∆t
А lim
А кон.
А нач.
А3
∆А
А2
А нач.
А нач.
А1
А кон.
А0
А нач.
t0 t1 t2 t3
(А1 - А0) + (А2 – А1) + (А3 – А2)
С обр. = ——————————————— х F
t3 – t0
Т (время)
Т нач.
Т кон.
Т (время)

20. Нелинейная многоточечная калибровка

Кривая реакции
Калибровочный график
(изменение оптической плотности
в зависимости от времени)
(зависимость оптической плотности
от концентрации)
Количество
преципитата
А (опт. плотн.)
Эквивалентность
Избыток
антитела
Избыток
антигена
А
А45
А3
А2
А1
Концентрация
антигена
С1 С2 С3 С4 С5
С (конц.)

21. Что же такое современный фотометр?

22. Требования

предъявляемые к современному фотометру:
Низкая стоимость.
Простота эксплуатации и удобный интерфейс.
Возможность программирования.
Возможность кинетических измерений.
Малый объем реакционной кюветы.
Совместимость с компьютером.
Гарантийное и послегарантийное
обслуживание.
Наличие или возможность подключения
проточной кюветы.
Высокая точность измерений.

23. Классическая оптическая схема фотометра

Классическая
оптическая
схема
Диафрагмы
Карусель
с
фильтрами
Фотоприемник
Фотоприемник
Теплозащитный
фотометра
референсного
луча
фильтр
Промежуточная
Кювета
диафрагма
Интерференционный
Конденсорные
Зеркало
светофильтр
линзы
Кюветное
отделение
Светоделительная
пластина
Проекционная
линза

24. Многофункциональные фотометры

Наряду с одно- и двухканальными появились и
многоканальные фотометры, позволяющие
измерять одновременно большое количество
проб, что существенно ускоряет процесс
измерения.

25. Преимущества автоматизированных фотометров

Главной отличительной особенностью
автоматических фотометров (спектрофотометров)
от автоматических анализаторов является
необходимость вручную смешивать
анализируемый образец с реактивами.

26.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ