Транскрипция стрессоустойчивых бактерий

1. Как и зачем мы изучаем транскрипцию стрессоустойчивых бактерий

Бактериальная транскрипция. Как её исследуют
Природа радиоустойчивости Deinococcus radiodurans
Особенности транскрипции бактерий Deinococcus
Чем ещё занимаются в нашей лабе
Алексей Агапов
[email protected]
29 марта 2019 г.

2.

Транскрипционный цикл
Терминация
-35
-10
Инициация
Расщепление РНК
Элонгация
2

3.

Схема элонгационного комплекса бактериальной
РНКП
3

4.

Стрессоустойчивость D. radiodurans
Геном
Клеточная оболочка
Антиоксидантные
системы
Детоксикация
Mn2+
Репарация ДНК

5.

Стрессоустойчивость D. radiodurans

6.

Стрессоустойчивость D. radiodurans
Геном
Клеточная оболочка
Антиоксидантные
системы
Детоксикация
Mn2+
Репарация ДНК
Транскрипция?

7.

Стрессоустойчивость D. radiodurans

8.

Стрессоустойчивость D. radiodurans

9.

Схема элонгационного комплекса бактериальной
РНК-полимеразы

10.

Gfh-факторы (Gre factor homologs)
• Есть только у бактерий филума
Deinococcus-Thermus
• В отличие от Gre-факторов не
активируют расщепление РНК
Gfh1 Tth
(Tagami et al., 2010)
• Gfh1 Tth ингибирует инициацию
транскрипции
• Концентрация Gfh1 повышается
в клетках Dra при стрессе
RNA
||||||||
|||||||| |||||||| ||||||||
Gfh1

11.

Gfh-факторы усиливают транскрипционные паузы
hisP – шпилькозависимая
Gfh1
Gfh-факторы Dra
активируются в
присутствии Mn2+
Esyunina et al., 2016
… и терминацию транскрипции

12.

13.

Исследуемые повреждения в ДНК
8-oxoG
O6-meG
AP-site
1-N6-ethenoA
thymine glycol
thymine dimers
(CPD)

14.

Искусственные элонгационные комплексы
RNA
||||||||
5’
5’-GTTACTTGAGCTGCCC
||||||||||||||||
3’-TTACTGGTCCGG CAATGAACTCGACGGG
|||||||||
5’-UUCGACCAGGCC
X

15.

Точность синтеза РНК на поврежденных матрицах
G
G
Эффективность и точность включения нуклеотидов
напротив повреждений снижаются

16.

Gfh1 Dra усиливает паузу на поврежденном нуклеотиде
матрицы
Mn2+

17.

Роль фактора Mfd в транскрипции
Mfd
RNA
||||||||
|||||||| |||||||| ||||||||
Транслоказа Mfd у E. coli смещает остановленные
транскрипционные комплексы с поврежденных участков ДНК

18.

Действие Mfd и Gfh1 Dra на остановленные
транскрипционные комплексы
Mfd
bio
РНК
|||||||| |||||||| ||||||||
||||||||
|||||||||
РНК
Gfh1
супернатант
осадок
bio
Mfd
|||||||| |||||||| ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||
Gfh1

19.

Mfd действует на остановленные транскрипционные
комплексы совместно с Gfh1 Dra

20.

Предполагаемая роль Gfh-факторов
Mfd
RNA
|||||||||| ||||||||||
|||||||||||||||||||||||||||
Gfh1
Gfh ингибируют транскрипцию, стабилизируя неактивную
конформацию РНКП
транскрипция, диссоциация РНКП
способствует процессам репарации и репликации?

21.

Текущие исследования
• Анализ Gre-подобных факторов других бактерий: D. gobiensis, D.
peraridilitoris, Brevundimonas sp. leaf
• Дальнейшее изучение механизма сопряжения транскрипции с
эксцизионной репарацией нуклеотидов: сборка in vitro системы
репарации NER D. radiodurans
• Поиск белков, ассоциированных с РНКП D. radiodurans в
стрессовых условиях, методом pull-down и массспектрометрического анализа
• Изучение блокирования транскрипции белком dCas9 in vitro

22.

Чем ещё занимаются в (мета)лаборатории
• Инициацией транскрипции
• Эукариотическими ДНК-полимеразами (лаба А.В. Макаровой)
• Прокариотическими аргонавтами (мегагрант А.А. Аравина)
• Плазмидами с природной устойчивостью ко всему на свете
(группа М.А. Петровой)