Молекулярно-генетическая диагностика мужского бесплодия

1. Молекулярно-генетическая диагностика мужского бесплодия

2.

Бесплодие является важной медико-социальной проблемой в связи с
высокой частотой отсутствия беременности естественным путем,
встречающегося в среднем у 15 % супружеских пар. В структуре проблем
деторождения на долю «мужского фактора» приходится до 50 % случаев
бесплодия в браке. Нарушение фертильности отмечают у 5–7 % мужчин, при
этом в 50– 60 % случаев бесплодия в браке диагностируют снижение
количественных и/или качественных показателей эякулята, что может быть
обусловлено дефектами спермато- и/или спермиогенеза, дозревания
сперматозоидов в эпидидимисе, реже – нарушением проходимости
семявыносящих путей, секреции придаточных мужских половых желез,
эректильной дисфункцией.

3. Общие положения

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Мужское бесплодие — это нарушение мужской репродуктивной функции,
которое выражается в количественном или качественном изменении
сперматозоидов. Их либо слишком мало, либо они слишком слабы, чтобы
достигнуть яйцеклетки и оплодотворить ее.
Причины мужского бесплодия:
• Эндокринные нарушения (19% случаев). Сбои в гормональном фоне — одна из
самых частых причин гибели сперматозоидов и отказа семенников производить
новые.
• Варикоцеле (15% случаев). Расширение сосудов в яичках и семенном канатике
приводит к повышению комфортной для развития сперматозоидов температуры
34°С. Это чревато повреждением и гибелью семени.
• Врожденные аномалии (12% случаев). Генетические патологии, перекручивание
и неопущение яичек приводят к нарушению развития детородной функции.
Исправить ситуацию можно в первые недели после рождения мальчика.
• Инфекционные заболевания (10% случаев). Заболевания, передающиеся
половым путем (хламидиоз, гонорея, трихомониаз и др.), безусловно, на первом
месте по уровню опасности. Но и другие инфекции, такие как бруцеллез, паротит
(свинка), могут приводить к повреждениям производящих сперматозоиды клеток.

4.

• Воспаления простаты и мочеточников становятся причиной бесплодия в 9%
от общего числа случаев.
• Причины
сексуального
характера:
преждевременная
эякуляция,
недостаточная эрекция или ее отсутствие. Для решения подобных проблем
лучше обращаться не к андрологу, а к сексологу.
• Новообразования в яичках (3% случаев), как доброкачественные, так и
злокачественные, нарушают потенцию.
• К менее распространенным причинам патологии могут относиться: снижение
общего иммунитета, прием антибиотиков и других лекарств, психогенные
факторы. Тесное белье, любовь к горячей бане, активные занятия спортом также
могут привести к потере жизнеспособности сперматозоидов.

5.

Известно, что генетические факторы обусловливают по крайней мере 30–50 %
всех случаев тяжелых форм бесплодия у мужчин. Сперматогенез является
сложным биологическим процессом, который зависит от точно контролируемого
каскада активации и деактивации определенных генов. Результатом работы этих
генов является процесс созревания сперматозоидов из клеток-предшественников
(сперматогониев). У человека в этот процесс вовлечено более 2000 генов. По
причине генетических нарушений могут возникнуть разные по своей этиологии и
степени тяжести формы бесплодия: от незначительных нарушений сперматогенеза
до полной дисфункции гонад.
Среди генетических факторов мужского бесплодия выделяют три основных:
• изменения генетического аппарата на уровне хромосом (хромосомные
аберрации),
• на уровне гена или группы генов (мутации),
• на уровне тотальной ДНК (дисперсия хроматина и фрагментация ДНК).
Вот почему кроме стандартных морфологических, биохимических тестов при
мужском бесплодии рекомендовано применять молекулярно-цитогенетические и
молекулярно-генетические методы, которые позволяют оценить состояние
генетического аппарата соматических и половых клеток у мужчин.

6. Методы диагностики

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
1.) Цитогенетический анализ, или кариотипирование
2.) Молекулярно-цитогенетические методы (FISH)
3.) Молекулярно-генетические методы:
Хромосомный микроматричный анализ (ХМА)
Секвенирование нового поколения (NGS)
Делеции в AZF локусе Y хромосомы
Мутации гена CFTR
Делеция в SRY локусе
Метод «TUNEL»
Метод «SCSA»
Метод «COMET ASSAY»
Использование GWAS
фертильности у мужчин
в
поиске
генов,
связанных
с
нарушением

7. Хромосомный микроматричный анализ(ХМА)

ХРОМОСОМНЫЙ МИКРОМАТРИЧНЫЙ
АНАЛИЗ(ХМА)
ХМА является новым молекулярно-цитогенетическим методом, позволяющим
выявлять изменение (увеличение или уменьшение) числа копий хромосомных
локусов в масштабе всего генома (см. таблицу).
В настоящее время для него используют биочипы, представляющие собой
матрицу с большим количеством (до нескольких сотен тысяч) точечно
нанесенных олигонуклеотидных последовательностей, перекрывающих весь
геном или его отдельные участки (кастомные чипы).
Анализируемую ДНК гибридизуют с подобным микрочипом; каждый сигнал
соответствует определенному локусу генома, изменение интенсивности сигнала
свидетельствует об изменении копийности того или иного участка хромосомы
Кариотип, определенный с помощью данного метода, получил название
«молекулярный». С учетом высокой разрешающей способности предложено
использовать ХМА в качестве генетического анализа первой линии, заменив
стандартное цитогенетическое исследование (анализ кариотипа) при
несиндромальных врожденных пороках развития и умственной отсталости
неясного генеза, а также при подозрении на наличие микроделеционных и
микродупликационных
синдромов
или
других
несбалансированных
хромосомных аберраций

8.

9. Секвенирование нового поколения

СЕКВЕНИРОВАНИЕ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ
Мощным технологическим прорывом в генетике и в молекулярной медицине
явилась разработка технологий NGS.
Данный молекулярно-генетический метод основан на одновременном
параллельном секвенировании миллионов коротких фрагментов ДНК с
последующей биоинформатической «сборкой» и анализом полученных
фрагментов генома с помощью специальных компьютерных программ.
Сравнение
результатов
анализа
с
референсной
(нормальной)
последовательностью ДНК позволяет выявить различные типы мутаций в
масштабах всего генома или его отдельных частей.
Секвенирование экзома или всего генома позволяет производить поиск
мутаций без подозрения на генетические изменения в каком-то конкретном гене
(генах) или локусе.

10.

11.

12. Делеции в AZF локусе Y хромосомы

ДЕЛЕЦИИ В AZF ЛОКУСЕ Y ХРОМОСОМЫ
В последние годы начато активное исследование микроструктурных
перестроек хромосом, CNV, в том числе при различных формах нарушения
развития и функции органов мужской и женской репродуктивной системы, при
бесплодии и не вынашивании беременности, а также для детекции (скрининга)
хромосомных мутаций у эмбриона до его имплантации и у плодов при потере
беременности. Среди известных CNV при мужском бесплодии впервые были
описаны, в дальнейшем очень хорошо изучены и широко исследованы
микроделеции длинного плеча хромосомы Y.В настоящее время исследование
делеций в локусе AZF рутинно проводят многие генетические лаборатории для
диагностики мужского бесплодия.
В данном участке Yq эухроматина (локусы Yq11.21–23) картированы 3 (суб)
региона AZF: AZFa, AZFb и AZFc, полные делеции которых приводят к
секреторной азооспермии и олигозооспермии тяжелой степени

13. Делеции в AZF локусе Y хромосомы

ДЕЛЕЦИИ В AZF ЛОКУСЕ Y ХРОМОСОМЫ
Делеции локуса AZFc выявляются чаще делеций AZFa и AZFb.
Манифестация делеции – отклонения в спермограмме из-за нарушения
сперматогенеза при сохраненной эндокринной функции яичек.
Гистологическая картина варьирует от полного или очагового Сертоликлеточного синдрома до блокады сперматогенеза.
Диагностика осуществляется с помощью мультиплексной полимеразной
цепной реакции (мПЦР), когда происходит амплификация и анализ
определенных маркерных последовательностей ДНК длинного плеча Yхромосомы.
Мультиплексная ПЦР – полимеразная цепная реакция, в которой
одновременно используют более одной пары олигонуклеотидных праймеров,
что приводит к коамплификации нескольких ДНК-матриц.

14. Мутации гена CFTR

МУТАЦИИ ГЕНА CFTR
Трансмембранный регулятор муковисцидоза (англ. CFTR — Cystic Fibrosis
Transmembrane conductance Regulator) — это белок, участвующий в транспорте
ионов хлора через мембрану клетки. Такое же название имеет ген, кодирующий
этот белок. Наличие мутаций в обеих копиях гена CFTR ведет, как правило, к
развитию самого распространенного наследственного аутосомно-рецессивного
моногенного заболевания — муковисцидоза, а также может быть причиной
мужского бесплодия.
Ген CFTR человека расположен на длинном плече хромосомы 7 в области
q31. На данный момент известно более 900 видов различных мутаций гена
CFTR. Около 70 % случаев заболевания муковисцидозом обусловлено делецией
трех пар оснований, кодирующих аминокислоту фенилаланин в 508-м
положении трансмембранного регуляторного белка — delF508. Помимо этого,
наблюдаемая у мужчин обструктивная азооспермия в 25 % случаев является
следствием одностороннего или двухстороннего врожденного отсутствия
семявыносящих протоков, которое возникло по причине мутаций в гене CFTR.
Поэтому скрининг перед процедурой интрацитоплазматической инъекции
сперматозоида (ИКСИ) обязательно включает молекулярно-генетические
исследования этого гена. Для диагностики данной мутации используется метод
ПЦР в реальном времени.

15. Фрагментация тотальной днк

ФРАГМЕНТАЦИЯ ТОТАЛЬНОЙ ДНК
С целью исследования состояния тотальной ДНК (дисперсии хроматина и
фрагментации ДНК) используют методы :
• TUNEL (Terminal uridine deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)
Суть метода заключается в выявлении разрывов ДНК в апоптотирующих
клетках, обработанных "сшивающими" фиксаторами. Для этого к 3’-ОН
концевым фрагментам разрывов ДНК с помощью фермента терминальной
дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) присоединяется модифицированный
нуклеотид (например, BrdUTP), который далее визуализируется с помощью
моноклональные антитела (МКА), конъюгированных с флюорохромом.
В настоящее время для использования указанного метода разные фирмы
выпускают как отдельные реагенты, так и полные наборы реактивов (Kit),
рассчитанные на то или иное количество определений.

16.

«TUNEL»

17. Метод «Comet Assay»

МЕТОД «COMET ASSAY»
Гелевый электрофорез на единичных клетках, получивший название "Comet
Assay", в настоящее время нашел применение для анализа степени
фрагментации спермальной ДНК.
Клетки, находящиеся в геле агарозы, подвергаются воздействию
определенной комбинации реагентов с целью разрушения мембран и
экстракции гистонов и протаминов. Под влиянием электрического поля
происходит миграция фрагментов ДНК, не связанных с ядерным матриксом, к
положительному электроду. При окраске ДНК-специфическими красителями
создается эффект "кометы", где длина хвоста "кометы" и интенсивность сигнала
отражают степень фрагментации ДНК.
Таким образом, название "Comet" связано с тем, что окрашенные клетки
после такой процедуры имеют форму кометы, ядро которой составлено
основной массой высокомолекулярной ядерной ДНК, а хвост "кометы"
представляет собой фракцию относительно низкомолекулярной ДНК,
образовавшейся в результате появления разрывов в высокомолекулярной
хромосомной ДНК.

18. Метод «Comet Assay»

МЕТОД «COMET ASSAY»
Существуют 2 модификации метода – нейтральная и щелочная.
В первом случае регистрируются разрывы только обеих нитей ДНК, во
втором случае видны разрывы и одной, и двух нитей. Comet является одним из
наиболее чувствительных методов оценки повреждения ДНК.
Одним из его недостатков является недостаточная стандартизованность
протоколов исследования. Кроме того, щелочная методика показывает
большое количество "комет" во всех клетках, возможно вследствие присутствия
в сперматозоидах областей, неустойчивых в щелочной среде, что затрудняет
идентификацию эндогенных и индуцированных повреждений ДНК. Тем не
менее в клинических исследованиях показана эффективность Comet как
метода оценки функции сперматозоидов и мужской фертильности, а также его
способность прогнозировать исходы ВРТ

19. Генетическое обследование пациентов с азоо- или олигозооспермией позволяет:

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ ПАЦИЕНТОВ С АЗООИЛИ ОЛИГОЗООСПЕРМИЕЙ ПОЗВОЛЯЕТ:
1. Сократить сроки обследования и, следовательно, лечения.
2. Избежать ненужного дорогостоящего эмпирически назначаемого
лечения.
3. Поставить этиологически корректный диагноз, а не констатировать
имеющиеся симптомы.
4. При наличии хромосомных или генетических аномалий, благодаря
вспомогательной репродуктивной технологии (ВРТ) пара может
забеременеть и родить здорового ребенка в случаях использования
преимплантационной и пренатальной диагностики.

20. Используемая литература

ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Глинкина Ж.И., Леонов Б.В., Бахарев В.А., Лукин В.А. ПГД врожденных и
наследственных заболеваний методом FISH в программе ЭКО и ПЭ. В кн.: Лечение
женского и мужского бесплодия. Вспомогательные репродуктивные технологии.
Под ред. В.И. Кулакова, Б.В. Леонова, Л.Н. Кузьмичева. М.: Медицинское
информационное агентство, 2005. C. 162–197.
2. Курило Л.Ф., Андреева М.В., Коломиец О.Л. и др. Генетические синдромы с
нарушениями развития органов половой системы. Андрология и генитальная
хирургия 2013, 17–27.
3. Черных В.Б. Генетические факторы мужского бесплодия. Материалы. Всерос.
науч.-практ. конф. «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний:
возможности и перспективы». Медицинская генетика 2006; 2 (прилож.).