Методы анализа кариотипа человека. Стандартные цитогенетические, молекулярно-цитогенетические, молекулярные методы

1. Медицинская генетика

Методы анализа кариотипа человека
• стандартные цитогенетические,
• молекулярно-цитогенетические,
• молекулярные методы.

2. Показания для проведения цитогенетической диагностики (Наследственные болезни: национальное руководство)

1
Нарушения репродуктивной функции неясной
этиологии у мужчин и женщин:
1.1
спонтанные аборты (два и более) на разных сроках
беременности, мертворождения или рано умершие дети;
1.2 первичная аменорея;
1.3
Мужское и женское бесплодие при исключении
гинекологических заболеваний у женщин;
2
Множественные врожденные пороки развития у
ребенка
3
Задержка умственного и физического развития у
ребенка
4
Подозрение на хромосомную болезнь на основании
клинических симптомов

3. Показания для проведения цитогенетической диагностики (Наследственные болезни: национальное руководство)

5
Пренатальная и предимплантационная диагностика
при повышенном генетическом риске
6
Подозрение на синдромы, характеризующиеся
хромосомной нестабильностью (учет хромосомных
аберраций и сестринских хроматидных обменов)
7
Гемобластозы и онкологические заболевания
8
Оценка мутагенных воздействий

4.

Цитогенетическая диагностика
Метафазные хромосомы
Стандартные методы
цитогенетического анализа
(культивирование клеток,
приготовление препаратов хромосом,
дифференциальное окрашивание),
молекулярно-цитогенетические
методы
Хроматин интерфазных
ядер, молекулы ДНК
Методы молекулярноцитогенетического и молекулярного
анализа
Цитогенетическая диагностика может быть выполнена на разных
стадиях онтогенеза человека:
Преконцепционная
Конститутивный
Предимплантационная
кариотип
Пренатальная
Постнатальная
Онкоцитогенетика – анализ кариотипа отдельных соматических клеток

5. Методы анализа кариотипа

• Цитологическое исследование полового хроматина в
ядрах клеток буккального эпителия (экспресс-анализ
аномалий половых хромосом)
• Стандартное цитогенетическое исследование – анализ
метафазных хромосом с помощью методов
дифференциального окрашивания («золотой стандарт»)
• Молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH –
флуоресцентная in situ гибридизация специфических ДНКпроб с ДНК метафазных или интерфазных хромосом)
• Молекулярные методы исследования (array-CGH –
сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах;
QF-PCR – количественный анализ полиморфных локусов
хромосом, NGS – анализ количественных нарушений
методами секвенирования )

6. Краткая историческая справка

Murray L Barr, Ewart G (Mike) Bertram,
1949 г. – описание полового хроматина в
интерфазных ядрах клеток.
Mary Lyon, 1961 – выдвинута гипотеза
случайной инактивации X хромосомы

7. Цитологическое исследование полового хроматина

Экспресс-диагностика аномалий
в системе половых хромосом. Как
правило выполняется на ядрах
клеток буккального эпителия.
Нативное окрашивание
ацеторсеином
Иммунофлуоресцентное
окрашивание гистона
macroH2A, связанного с
неактивной Ххромосомой

8.

Кариотипирование – диагностическое исследование
хромосом пациента, которое включает в себя определение
числа хромосом (исключение геномных мутаций) и
анализ структуры хромосом (исключение хромосомных
мутаций)
Стадия клеточного цикла
Методы получения
препаратов хромосом
Прямые: используются
клетки, делящиеся in vivo
•клетки костного мозга,
• клетки цитотрофобласта
Непрямые: используются
клетки,
делящиеся in vitro
•лимфоциты периферической крови
•фибробласты кожи
•амниоциты

9. Краткая историческая справка

TC Hsu, 1952 – внедрение гипотонической обработки клеток
при приготовлении препаратов хромосом, начало «новой
эры» в истории цитогенетики.
Peter Nowell, 1960 – использование
фитогеммаглютинина в качестве митогена
при культивировании лимфоцитов.
Torbjörn Caspersson, 1969-1971 гг. – разработка метода
дифференциального окрашивания хромосом.

10. Стандартное кариотипирование

Культивирование лимфоцитов периферической крови
Требования к
биологическому материалу:
1. Использование
антикоагулянта
(гепарина)
2. Стерильность
Культура лимфоцитов:
•Кратковременная (72 ч)
•Митоген (ФГА)
•Цитостатик (колхицин)
•Гипотоническая
обработка клеток
•Фиксация клеток
•Приготовление
препаратов

11. Стандартное кариотипирование

1. Получение препаратов метафазных
хромосом
2. Дифференциальное окрашивание хромосом
3. Микроскопический анализ числа и
структуры хромосом
4. Цитогенетическое заключение

12. Методы дифференциального окрашивания хромосом

G-окрашивание красителем Гимза после обработки протеолитическим
ферментом трипсином (GTG)

13. Методы дифференциального окрашивания хромосом

Q-окрашивание флуорохромом Hoechst 33258 с
контрастированием Actinomycin D (QFH/AcD)

14. Методы дифференциального окрашивания хромосом

R-окрашивание красителем акридиновый оранжевый с использованием
бромдезоксиуридина во второй половине S-периода (RBA). Идентификация
инактивированной X хромосомы

15.

Цитогенетическое исследование
абортного материала при
диагнозе замершая
беременность раннего срока
Результат
кариотипирования:
46,XX,+13,der(13;14)(q10;q10)
Заключение:
В клетках цитотрофобласта
ворсинчатого хориона выявлена
транслокационная форма
трисомии по аутосоме 13
(синдром Патау)
Рекомендации:
1. Кариотипирование
супружеской пары
2. Консультация врача-генетика

16. С помощью методов стандартного кариотипирования

можно:
• идентифицировать все
числовые аномалии целых
хромосом
• выявить структурные
перестройки хромосом на
уровне разрешения 300-850
блоков на гаплоидный набор
• выявить хромосомный
мозаицизм при
определенном количестве
анализируемых клеток
нельзя:
• выявить нарушения в
кариотипе неделящихся
клеток
• в большинстве случаев
достоверно установить
микроделецию или
микродупликацию
• установить природу
добавочного материала и
маркерных хромосом

17. Маркерная хромосома

ПД: плацентобиопсия на
сроке 15/16 недель
Показания - возраст,
БХМ I триместра (1,0/3,86),
риск 1:133
Кариотип в клетках
цитотрофобласта –
47,XX,+mar[21]/46,XX[8]
Рекомендации:
1. Молекулярно-цитогенетическая диагностика (FISH)
для установления природы маркерной хромосомы
2. Кордоцентез

18. Молекулярно-цитогенетическая диагностика

Fluorescent in situ hybridisation (FISH)
Подготовка цитологического препарата
Выбор и подготовка ДНК-пробы
Обработка препарата перед гибридизацией
Проведение гибридизации in situ
Постгибридизационная обработка препарата
Анализ результатов
Заключение по результатам исследования

19. Развитие методов молекулярной цитогенетики на основе технологии FISH

• Методы общего анализа
кариотипа (многоцветная
FISH, SKY, RxFISH, CGH)
• Методы селективного
хромосомного анализа (анализ
численных и структурных
аномалий конкретных
хромосом)
• Методы общего анализа
индивидуальных хромосом
(multi color banding,
«обратная» FISH )
Н.Б.Рубцов, Т.В. Карамышева, Т.А.Гайнер. Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа и
диагностика хромосомных патологий.//Геномика-медицине.2005

20. ДНК-зонды

CEP (Chromosome Enumeration Probe)
α- сателлитная ДНК (центромеры)
III сателлитная ДНК (1, 9, 16, 15, Y)
CEP9 CEP15 LSI5p15.2
LSI (Locus Specific Identificator)
микроделеционные пробы
онкологические пробы
CEPX CEPY CEP18
WCP (Whole Chromosome Paints)
TEL (Telomere probe)

21.

Синдром Паллистера-Киллиана: дополнительная изохромосома по
короткому плечу хромосомы 12
12
CEP12
12
CEP12
i(12)(p10)
p
разрыв
p
p
q
i(12)(p10)
Хромосома 12
Лимфоцит крови – 46,XX

22. С помощью метода FISH

можно
исследовать хромосомы неделящихся
клеток
выявить анеуплоидию по
интерфазным ядрам
выявить и уточнить выявленный
хромосомный мозаицизм
уточнить точки разрывов при
структурных перестройках
хромосом
установить природу добавочного
хромосомного материала и
маркерных хромосом
выявить микроперестройки
хромосом (при предполагаемом
диагнозе)
нельзя
• провести полное
исследование всех
хромосом набора
(анализируется
конкретный локус
конкретной
хромосомы)

23. Молекулярно-биологические методы: QF-PCR (КФ-ПЦР количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция)

КФ-ПЦР позволяет проводить
молекулярный анализ анеуплоидий на
некультивируемых эмбриональных
клетках.
Принцип КФ-ПЦР основан на анализе
высокополиморфных коротких
тандемных повторов - STR-маркеров
(гипервариабельных
последовательностей в геноме длиной
2-7 пар оснований), определенных для
каждой хромосомы.
Число аллелей может быть
определено с использованием
флуоресцентно меченых хромосомспецифичных праймеров для каждого
из STR маркеров.

24.

1 :1:1
2:1

25.

disomic
1
:
1
ATTT
ratio
25
4
trisomic
6
2
:
repeat units
1
4
6
trisomic
1
4
uninformative
:
1
5
:
1
6

26.

Принцип метода КФ - ПЦР
Материнская хромосома
ПЦР
Отцовская хромосома
индивидуумы
Гель
электрофорез
КФ - ПЦР
Аллель 1
Аллель 2
Аллель 3
индивидуумы
Норма
Гетерозигота 1:1
Гомозигота ( неинформативна)
Гетерозигота 1:1:1
трисомия
Гетерозигота 1:2
Гомозигота ( неинформативна)

27.

КФ-ПЦР детекция STR маркеров на хромосомах 13,
18, 21 у плода с трисомией 21 (синдромом Дауна)
D21S11
D21S1437
D18S391
D13S742
D18S380
D21S1411
D13S634
D18S386
D18S535
D21S226
D13S628

28. Использование методов FISH и QF-PCR в целях пренатальной диагностики

преимущества
• возможность анализа
некультивированных клеток
• скорость и производительность
недостатки (объективные)
• Селективный анализа
индивидуальных хромосом. На
по результатам QF-PCR – 47,XXX
основании определения числа копий
отдельных участков нескольких
хромосом заключение о кариотипе
(числе и структуре всего хромосомного
набора) некорректно.
• Остаются проблемы анализа
малопроцентного мозаицизма.
При кариотипировании лимфоцитов 45,X/46,X,i(X)(q10)/47,X,i(X)(q10),i(X)(q10)
• Не решается проблема структурных
перестроек хромосом.

29. Сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах (array-CGH)

Метод выявления несбалансированных структурных
перестроек хромосом и анеуплоидий по целым хромосомам.
Разрешающая способность метода позволяет
идентифицировать микроделеции и микродупликации,
невидимые при стандартном кариотипировании
Показания:
•Идиопатическая задержка
умственного и физического
развития у ребенка
•МВПР у плода

30.

Сравнительная геномная гибридизация принцип метода
выделение ДНК из клеток пациента
перекрестное мечение контрольной ДНК и
ДНК пациента (Cy3 и Cy5)
гибридизация на матрице
смеси из равных
ВВ
количеств меченных сравниваемых образцов
Сканирование результатов гибридизации
Обработка полученных данных

31. Сравнительная геномная гибридизация

Результаты
сравнительной
геномной
гибридизации
ДНК клеток
бластоцисты
(зеленое
мечение) с
референсной
ДНК 46,XY
(красное
мечение).
Результат
верифицирован
методом FISH
Fragouli E et al. Hum. Reprod. 2011;26:480-490
© The Author 2010. Published by Oxford University Press on behalf of the European Society of
Human Reproduction and Embryology. All rights reserved. For Permissions, please email:
[email protected]

32. Сравнительная геномная гибридизация (ПГД)

33. С помощью сравнительной геномной гибридизации

Можно:
•исследовать аномалии кариотипа без цитологических
препаратов, использовать клетки разных тканей
•в отличие от FISH и QF-PCR в одном эксперименте
провести анализ числа всех хромосом и выявить
несбалансированные микроперестройки по всему геному
(в зависимости от плотности покрытия хромосом на
матрице)
Нельзя:
•выявить сбалансированные структурные перестройки!
•выявить низкоклональный мозаицизм (менее 10%)

34.

Высокопроизводительное
секвенирование
Dagan Wells, 48th Annual Postgraduate
Program, ASRM, 2015

35.

Dagan Wells, 48th Annual Postgraduate Program, ASRM,
2015

36. Методы анализа кариотипа

Стандартное кариотипирование на метафазных
хромосомах с помощью методов дифференциального
окрашивания (геномные мутации, хромосомные мутации,
выявляемые на уровне 300-850 блоков).
Молекулярно-цитогенетические методы (FISH) –
уточняющая диагностика структурных перестроек
хромосом, анализ мозаицизма, выявление аномалий
числа отдельных локусов хромосом и структурных
перестроек хромосом в интерфазных ядрах клеток.
Молекулярно-генетические методы (QF-PCR, arrayCGH) – диагностика анеуплоидий по целым хромосомам
и несбалансированных структурных перестроек хромосом
без использования цитологических препаратов.