Болезни экспансии некодирующих повторов (синдром Мартина-Белл, атаксия Фридрейха). Методы молекулярно-генетической диагностики

1.

Семинар 5
Немцова М.В.
Медицинская генетика
Фармация Курс 3 ЦИОП «Медицина
будущего»
Болезни экспансии некодирующих повторов
(синдром Мартина-Белл, атаксия Фридрейха).
Методы молекулярно-генетической
диагностики.

2. Общие методы

Выделение ДНК
Полимеразная цепная реакция
Рестрикционный анализ
Электрофорез в полиакриламидном и
агарозном геле
Блотинг по Саузерну

3. Оборудование для ДНК-диагностики

Оборудование для ДНКдиагностики
Амплификаторы
Термостаты настольные для
пробирок (от 25-95С)
Центрифуга для микропробирок
Трансилюминатор

4. Источники геномной ДНК

Цельная кровь
Культура клеток
Букальный эпителий
Пятна высушенной крови
Другие источники
Сыворотка, плазма крови, образцы
мочи, образцы тканей
При делециях мтДНК
предпочтительный материал –
образец мышечной ткани
Блоки фиксированной ткани

5. Электрофорез – метод разделения белков, нуклеиновых кислот по размерам фрагментов или частиц в акриламидном или агарозном геле

под действием
электрического тока.

6. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле

Буфер
Фрагменты ДНК
Агарозный гель
Чем меньше фрагменты ДНК, тем
быстрее они передвигаются в геле

7. ПЦР

Состав реакционной смеси:
Исследуемый образец
Буфер, содержащий ионы магния
Смесь АТФ, ТТФ, ГТФ,СТФ
Taq-полимераза
Специфические олигонуклеотидные
праймеры

8. ПЦР

Стадии ПЦР
Денатурация
Отжиг
Элонгация

9.

Денатурация
Отжиг
Полимеризация
Tag-полимераза

10.

11. Специфичность ПЦР

12. Аллель-специфичная ПЦР

Один из
праймеров
коплементарен
мутантному
аллелю, другойнормальному.
Обратный праймер
– общий для двух
реакций
N M N M N M
1
2
3

13.

14. Аллель-специфичная амплификация

15. Мультилокусная ПЦР

ПЦР с несколькими парами праймеров,
соответствующих разным участкам гена
Пример –ДНК-диагностика делеций при
миодистрофии Дюшена

16.

Многолокусная ПЦР с флуоресцентно меченными
праймерами

17.

ПЦР-диагностика делеций в гене дистрофина при мышечной
дистрофии Дюшена.
1-маркер мол. веса; 2-6 и 7-11 – многолокусная ПЦР с
набором праймеров для амплификации различных экзонов
гена дистрофина: 2 – К-, 3 – К+, 4 – делеция 3-4 экзонов, 5 –
делеция 43 экзона, 6 – делеции нет; 7 – К-, 8 – К+, 9 –
делеция 6 экзона, 10 – делеция 19-32 экзонов, 11 – делеции
нет.

18. ПДАФ

Полиморфизм длины
амплифицированных
фрагментов
регистрация небольших
делеций и дупликаций
ДНК-диагностика мутации
ΔF508 при муковисцидозе
ДНК-диагностика заболеваний,
связанных с экспрессией
тринуклеотидных повторов

19. Эндонуклеазы рестрикции

Ферменты, узнающие
определенные короткие (4-8 пн)
последовательности в ДНК
(сайты) и разрезающие
двухцепочечную ДНК
- Пример: MspI (CCGG)
GCTGATCCGGGGCATGGTTCCGGAT

20. ПДРФ анализ

----------------CCGG-------норма
режет
----------------CCGA-------мутация не режет
MspI узнает
последовательность
’CCGG,
соответствующую
нормальному
аллелю
100 пн
MspI
300 пн
400 пн
400 пн
300 пн
100 пн

21. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

22. ДНК- диагностика аутосомно-рецессивного заболевания

23. КЛАССИЧЕСКАЯ ГАЛАКТОЗЕМИЯ

Характеристика гена GALT
-локализация гена 9p13
-11 экзонов
5’
экзоны:
1
2
3 4
5 6 7
8
9
10
11
Характеристика мутации
- Описано более 160 различных мутаций
- Мутации Q188R, K285N обуславливают тяжелый
фенотип (самые частые мутации 70-80%
аллелей)
- N314D обуславливает, т.н. вариант Дуарте
- S135L обуславливает легкий фенотип (62 %
аллелей, Африка)

24. ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ Q188R (исчезновение сайта рестрикции)

1. ПЦР экзонов 5-6 гена GALT –
фрагмент размером 477 п.н.
2. Рестрикционный анализ с
использованием фермента
рестрикции Bst2UI (CC^WGG)
3. При мутации Q188R исчезает сайт
рестрикции для Bst2U I и
Появляется фрагмент размером
377 п.н.
4. На рисунке справа:
1 – Q188R в гетерозиготном
состоянии
2 – норма
3 - Q188R в гомозиготном состоянии

25. ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ К285N (появление сайта рестрикции)

1. ПЦР экзона 9 гена GALT –
фрагмент размером 160 п.н.
2. Рестрикционный анализ с
использованием фермента
рестрикции Sse9 I (^AATT)
3. При мутации K285N возникает
сайт
рестрикции для Sse9 I и
появляются
фрагменты размером 98 п.н.
и 62 п.н.
4. На рисунке справа:
1– Норма
2 – K285N в гетерозиготном
состоянии
160 п.н.
98 п.н.
62 п.н.

26. ДНК-диагностика

Подтверждение диагноза
Диагностика носительства
Пресимптоматическая диагностика
Пренатальная (дородовая)
диагностика
Предимплантационная диагностика

27. Прямая ДНК-диагностика

Определение мутации,
являющейся непосредственной
причиной заболевания
Косвенная ДНК-диагностика
Определение хромосомы, несущей
поврежденный ген при семейном
анализе

28. ДНК-ДИАГНОСТИКА

ПРЯМАЯ ДНКДИАГНОСТИКА
Возможна только когда
известна структура гена
Возможна и без
больного члена семьи
(анализ ДНК родителей
пробанда)
Высокая точность
Возможна при
полилокусном
заболевании
КОСВЕННАЯ
ДНК-ДИАГНОСТИ КА
Возможна когда известно
положение гена, а
мутация или
последовательность
неизвестны
обязательно проведение
семейного анализа и
анализ образца больного
члена семьи
Точность зависит от
расположения маркеров
Обязательно наличие
одного локуса
заболевания

29. Прямая ДНК-диагностика

ПЦР ( мультиплексная ПЦР, аллельспецифическая амплификация,
ПДАФ)
ПЦР-ПДРФ анализ ( анализ
полиморфизма длины
рестрикционных фрагментов)
Секвенирование (определение
последовательности) гена
Блотинг по Саузерну
Биочипы

30. Методы поиска мутаций в генах

SSCP-анализ
Денатурирующий
гель
электрофорез или
денатурирующая ВЭЖХ
Секвенирование
Биочипы
Блотинг по Саузерну
(детекция крупных
перестроек)

31. SSCP-анализ

Анализ конформационного
полиморфизма однонитевой ДНК
Замена даже одного нуклеотида
приводит к измененим конформации
цепей, что изменяет их
электрофоретическую подвижность
Чувствительность 70-80%

32.

Схема проведения SSCP анализа
Нормальная ДНК (Н)
Мутантная ДНК (М)
денатурация
ренатурация однонитевой ДНК
н/н
н/м
м/м

33.

Схема проведения анализа гетеродуплексов (Н
Нормальная ДНК (Н)
Мутантная ДНК(М)
смешивание и
денатурация
гомодуплексы
гетеродуплексы
Н/Н
М/М

34. Диагностика нейрофиброматоза 1 типа (определение мутаций гена NF1 методом SSCP)

1
2 3
4
5
1
6
2
3
4
5
6
1
экзон 2
1
2
3
4
экзон 26
5
2
3
4
экзон 42
6
1
2
3
4
экзон 40
5
5
6
экзон 8
6
1
2
3
4
5
экзон 13
6

35. Гибридизация ДНК-ДНК - комплементарное взаимодействие между одноцепочечными полинуклеотидами из разных источников (ДНК-зонд и

ДНК-мишень)

36.

Прямое обнаружение мутации ΔF508 в ДНК девяти детей с CF.
ДНК амплифицируют с помощью ПЦР и помещают на мембрану
в двух экземплярах. Мембрану гибридизуют с одним из двух
специфичных олигонуклеотидных зондов. Нуклеотиды первого
зонда (олиго-N) комплементарны к нормальной
последовательности; последовательность второго зонда
является комплементарной к ДНК с делецией ΔF508. ДНК из
индивидуумов, гомозиготных по мутации гибридизуется
только со вторым зондом, ДНК индивидуумов гетерозиготных
по мутации гибридизуется с двумя олигонуклеотидами, и ДНК
от лиц, гомозиготных по нормальной последовательности
гибридизуется только с первым зондом.

37. FISH – флуоресцентная гибридизация in situ

38. Блотинг

1.
2.
3.
4.
5.
Саузерн-блотинг
Рестрикция
Разделение
изучаемого
фрагмента в геле
Денатурация
Перенос на
мембрану
Гибридизация с
меченной
пробой

39.

40.

41. Блоттинг-гибридизация

42. Секвенирование ДНК

43. Биочипы

Матрица на которую
нанесены тысячи
олигонуклеотидов
Олигонуклеотиды
специфично
гибридизуются с
меченными молекулами
ДНК

44. Косвенная ДНК-диагностика

Основана на
анализе
сцепления
Анализ
полиморфных
маркеров ДНК
1
1
2
4
3
2
3
4
1
3

45. Полиморфные варианты ДНК

Различия в последовательности ДНК
(Однонуклеотидные полиморфизмы –
SNP)
-----------AGGCTG-----------------------AAGCTG------------ Различия в длине последовательностей
----------AATG AATG-------------------------AATG AATG AATG------

46. Вариабельность ДНК

Около 99,7% ДНК-последовательности у
всех людей идентичны
Около 0,3% (примерно 10 000 000
нуклеотидов) различаются между
отдельными индивидами.

47. Повторяющиеся последовательности

Сателлитная ДНК – размер повторяющегося
элемента от нескольких сотен до нескольких
тысяч пн
Минисательтная ДНК (VNTR – variant number
tandem repeats) размер повторяющегося элемента
10-100пн
Микросательтная ДНК (STR – short tandem
repeats) размер повторяющегося элемента 2-6 пн

48. Анализ длин микросателлитных полиморфных повторов

49. Номенклатура ДНК-маркеров

ДНК-маркеры, расположенные за пределами
гена обозначаются согласно их положению на
хромосоме.
D16S539
D – ДНК
16- хромосома
S – единичная копия последовательности
539- 539 локус описанный на хромосоме 16

50. Выбор ДНК-маркеров

Внутригенные ДНК-маркеры
(полиморфизмы в генах )
Расположенные близко к исследуемому
гену. Фланкирующие ген с теломерной и
центромерной сторон

51.

Чем
ближе расположены маркеры к гену,
тем теснее они сцеплены, тем ниже
процент ошибки
A4
A3
М
A2
Н
A1
Расстояние
A4
A3
A4
М
A2
М
A2
Н
A1
оценивают в сантиморганидах
(1СМ –1%- 1000 000 пн)

52.

?

53. Пример

?
99 пн
96 пн
105пн
90пн

54. Пример

?
99 пн
96 пн
105пн
90пн

55. ДНК-диагностика

по возможности использовать
несколько подходов к диагностике
(например, прямые и косвенные)
анализ семейного материала даже в
случае прямой диагностики
Контроль воспроизводимости
результатов
Контроль на загрязнение плодного
материала материнским

56. Болезни экспансии тринуклеотидных повторов

Экспансия кодирующих
тринуклеотидных
повторов
CAG-повторы –
полиглутаминовые
тракты
Хорея Гентингтона
GCG,GCA,GCT,GCCповторыполиаланиновые тракты
1. Небольшое количество
повторений при
патологии
2. Новыя функция белка
3. Цитотоксический
эффект
Экспансия не
кодирующих
тринуклеотидных
повторов
Различные триплеты
Синдром Мартина-Белл
(УО FRAXA, FRAXE, FRAXF)
1. Большое количество
повторений
2. Расположены в
регуляторных областях

57. Синдром Мартина-Белл

- Нормальное телосложение
- Широкий лоб
- Удлинненное лицо
- Крупные оттопыренные уши
- Страбизм (косоглазие)
- Высокое арочное нёбо
Гиперэластичность суставов
- Мозоли (аутоагрессия)
- Пролапс митрального клапана
-
Макроорхизм
- Гипотония
- Мягкая эластичная кожа
-
Плоскостопие
- Судороги (~10%)
- Аутизм
-
-
Умственная отсталость

58.

59. Схема расположения фолатчувствительных ломких сайтов на Х-хромосоме

Схема расположения
фолатчувствительных
ломких сайтов на Ххромосоме

60.

61.

62. Проявлением синдрома Мартина-Белл (ломкой Х-хромосомы) является экспансия тринуклеотидного повтора (CGG)n, расположенного в

промоторной области гена FMR1 (Xq27.3)
Причиной синдрома Мартина-Белл (ломкой Х-хромосомы)
является аномальное метилирование промоторной области
гена FMR1 (Xq27.3)
Число
Метилирование Фенотип
триплетов промотора гена
СМБ
CGG
FMR1
норма
2-54
-
-
премутация
55-230
-
-
полная
мутация
230
+
+

63. ДНК-диагностика синдрома Мартина-Белл

Блотгибридизация
по Саузерну

64.

Молекулярно-генетическая диагностика
синдрома Мартина-Белл
М
1- ДНК нат., 2 –ДНК HpaII
1,2 – пациент FRAX; 3,4 – нормальный
мужчина; 5,6 - пациент FRAX; 7,8 –
нормальный мужчина
1
2
3
4
5
6
7
8

65. Multiplex PCR methylation test for FRAXA,FRAXE and FRAXF

1
2
3
4
5
6
7
8
9
FRAXA
FRAXF
FRAXE

66. Метил- специфичная ПЦР

Метилспецифичная ПЦР

67.

Определение количества CGG триплетов в гене FMR1,
ограничение метода - 130 повторов CGG

68.

Анализ метилирования промотора и длин CGG-повтора гена FMR1 у
пациентов женского пола методом метилспецифической ПЦР.
М
образец 1
образец 2
CpG (CGG)n СpG (CGG)n
- неметилированный промотор FMR1
– метилированный промотор FMR1
– метилированный промотор XIST
– неметилированный промотор XIST
(CGG)1-55
1 – здоровая девочка, повтор CGG в гетерозиготном состоянии в пределах нормы.
2 – пациентка с полной мутацией FMR1: превышение интенсивности сигнала
метилированного промотора FMR1 при сохранении соотношения
метилированный/неметилированный промотор XIST; один аллель CGG-повтора в
пределах нормы, второй (соответствующий полной мутации) не амплифицируется.
М – маркер молекулярного веса.

69. Диагностика синдрома Мартина-Бепп

1
п м
п
2
м
п
3
м
4
п м
п
5
м
п
6
м
п
7
м
п
8
м
п
9
м
М
н/м FMR1
м FMR1
м XIST
н/мXIST
1,2,4,9 – нормальные женщины
3 – женщина с полной мутацией FMR1 и аномальным метилированием
промотора
5,6,7,8 – семья с FRAX, 5 – мать с премутацией, 6 – больной сын с
полной мутацией FMR1 и аномальным метелированием промотора, 7 –
здоровая сестра пробанда без носительства, 8 - отец

70.

Диагностика синдрома Мартина-Белл
1. Исследование кариотипа пробанда для исключения
хромосомной патологии, не имеющей отношения к
СМБ
2. Анализ состояния метилирования промоторной
области FMR1 у больных без выраженной
хромосомной патологии: методом МЧ-ПЦР для
больных мужского пола и методом блотгибридизации по Саузерну для больных женского
пола
3. Анализ ДНК родственников выявленных больных с
СМБ для определения носителей премутаций и
полных мутаций. Метод выбора – анализ сцепления
по фланкирующим STR-маркерам.
4. Пренатальная диагностика по STR-маркерам на