Биохимия. Микробиология. Генетика

1.

Биохимия
Микробиология
Генетика
Докладчики:
3 курс МБХ Ишанова Диана
3 курс ББ Петухова Анна
Москва - 2016

2.

D. Cyranoski., 2016. CRISPR gene editing tested in a person // Nature. V. 539. P. 479

3. Серповидноклеточная анемия

● Моногенное заболевание с аутосомно-рецессивным типом
наследования (с неполным доминированием).
● Мутация в гене HBB (hemoglobin beta, конец короткого плеча
одинадцатой хромосомы, локус 11p15.4).
● Распространено на территории Чёрной Африки, Аравийского
полуострова и Индии, а также среди жителей Америки и Европы
африканского происхождения.
11
p15.4
https://ghr.nlm.nih.gov/gene/HBB/location.png

4. Серповидноклеточная анемия

Нормальный
эритроцит
Эритроцит свободно
проходит по сосудам
Нормальный эритроцит в разрезе
Нормальный
гемоглобин
Серповидный эритроцит в разрезе
Склеиваясь, эритроциты
забивают просвет
Серповидный эритроцит
сосуда
http://www.thelondonphysician.com/sickle-cell-anemia/
Аномальный
гемоглобин
формирует тяжи,
обуславливающие
серповидную
форму эритроцитов

5. Серповидноклеточная анемия

https://www.youtube.com/watch?v=QZngNSi8ofA

6. Методика эксперимента

• Для эксперимента использовались
индуцированные плюрипотентные
стволовые клетки, полученные из
эритробластов пациентов с
серповидноклеточной анемией (линия
TNC1) и из кроветворных клеток
костного мозга здоровых доноров (линия
BC1 – группа сравнения).
• У линии TNC1 мутантный ген HBB был
заменён на здоровый, после чего обе
линии были выращены до стадии
эритробластов.
Huang X, Wang Y, Yan W, Smith C, Ye Z, et al. (2015) Production of
gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes
differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle
point mutation. // Stem Cells 33(5): 1470-1479.

7.

Результаты
• Из 24 образцов, выбранных для
дальнейшего анализа, 12 содержали
нормальную копию HBB в
гетерозиготе:
• Из них самым подходящим для
исследований оказался клон SC15.
Huang X, Wang Y, Yan W, Smith C, Ye Z, et al. (2015) Production of
gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes
differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle
point mutation. // Stem Cells 33(5): 1470-1479.
• Экспрессия гена HBB в
различных линиях стволовых
клеток:

8. Муковисцидоз

● Моногенное заболевание с
аутосомно-рецессивным типом
наследования.
● Мутация в гене CFTR (cystic fibrosis
transmembrane regulator, середина
длинного плеча седьмой
хромосомы, локус 7q31.2).
● Регистрируется в большинстве
стран Европы с частотой 1:20001:2500 новорожденных, в России - с
частотой 1:10000 новорожденных.
q31.2
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/bc/Human_chromosome_07_-_550_bphs.png

9. Муковисцидоз

H2O
H2O
H2O
К настоящему времени
идентифицировано более
1600 мутаций и 250
полиморфизмов в гене
CFTR, их частоты широко
варьируют в разных
этнических группах.
Наиболее
распространенной
мутацией у больных белой
расы является ΔF508.
Cl-
Мутантный канал CFTR
не переносит ионы Cl-, что
приводит к накоплению
слизи снаружи клеток
H2O
Cl-
СЛИЗЬ
H2O
Cl-
Cl-
Нормальный канал
CFTR
перемещает ионы Clиз клеток наружу
http://learn.genetics.utah.edu/content/disorders/singlegene/cf/images/cf-channel.jpg
Cl-
H2O
ClCl-
Cl-
H2O

10. Муковисцидоз

• Прогноз при МВ остаётся
неблагоприятным и
определяется тяжестью
бронхолёгочных изменений. В то
же время, успехи диагностики и
терапии МВ привели к
значительному увеличению
продолжительности жизни
больных: если в 50-е гг. XX века
около 80% больных умирали в
возрасте до 10 лет, то в
настоящее время средняя
продолжительность жизни
больных МВ составляет 29 лет и
https://myhealth.alberta.ca/Health/_layouts/15/healthwise/media/medical/hw/h9991413_001.jpg
более.
http://fondnatasha.com/userfiles/images/myskoviscudoz_1.jpg

11. Методика эксперимента

Донорный вектор
Мутантный локус CFTR
(красным - место
делеции ΔF508)
Локус CFTR с
интегрированным
вектором
Исправленный локус
CFTR (зелёным - место
вставки)
Firth AL, Menon T, Parker GS, Qualls SJ, Lewis BM, et al. (2015) Functional Gene Correction for Cystic Fibrosis in
Lung Epithelial Cells Generated from Patient iPSCs.// Cell Reports 12(9): 1385-1390

12. Результаты

• Из 36 образцов, отобранных через 48 часов • Во всех из них было подтверждено наличие
после проведения процедуры CRISPR/Cas-9, специфичных последовательностей в хотя
6 содержали желаемую последовательность, бы одной аллели целевого участка:
эффективность метода составила 16,7%:
Нормальный
Вставка
• Ни в одном из образцов не было выявлено
наличие вставок в нецелевых участках
ДНК.
Firth AL, Menon T, Parker GS, Qualls SJ, Lewis BM, et al. (2015) Functional Gene Correction for Cystic Fibrosis in Lung Epithelial Cells Generated from
Patient iPSCs.// Cell Reports 12(9): 1385-1390

13. Мышечная дистрофия Дюшена

• Наследуется по рецессивному типу,
сцепленному с X-хромосомой.
• Мутация в гене дистрофин Хр21 (локус
31.12-33.36 Mb).
• Встречается с частотой 3 на 10000
новорожденных мальчиков.
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/fb/Chromosome_X.svg/125px-Chromosome_X.svg.png

14. Клиническая картина

http://gidmed.com/wp-content/uploads/2014/04/priznaki-miopatii-dyushena.jpg

15.

МДД
Пропуск экзона
Пре - мРНК. Делеция 50 экзона
Пре - мРНК. АО маскируют экзон 51
Пропуск 51 экзона
Сплайсинг
мРНК. Рамка считывания восстановлена
мРНК.Рамка считывания нарушена
Преждевременная
остановка трансляции
не функциональный дистрофин
трансляция
функциональный дистрофин
Пропуск мультиэкзона
Пре - мРНК. Мутации между 45 и 55 экзонами нарушают рамку считывания
у ~63% больных МДД.
пропуск экзонов
мРНК. Рамка считывания восстановлена
трансляция
Белок 45-55 функциональный
http://biomolecula.ru/img/content/1892/02.propusk-ekzona.png
Пропуск экзонов в гене дистрофина при
миодистрофии Дюшенна. а — Синтез
усеченного нефункционального или
нестабильного дистрофина (слева). Более
короткий, но частично функциональный
дистрофин (справа). б — Мультиэкзонный
пропуск в терапии МДД.

16.

6 месяцев
1 месяц
12 дней
утрофин/дистрофин
5 месяцев (болен)
23 месяца
интегрин/
дистрофин
2 года : здоров/болен
Животные модели миодистрофии Дюшенна. а — Проявления миодистрофии Дюшенна у мышей и
собак. . б — Сравнение продолжительности жизни здоровых и больных людей, собак и различных линий
мышей.
http://biomolecula.ru/img/content/1892/03.zhivotnye-modeli.png

17. Пигментный ретинит

Заболевания отличаются большой гетерогенностью и разнообразием клинических
проявлений. На сегодняшний день известно по меньшей мере 180 различных
генов, мутации в которых ассоциированы с приблизительно 20 ретинальными и
витреоретинальными патологиями.
● Сцепленное с полом — дефектный ген передаётся с Х-хромосомой от матери
к сыну; (RPGR)
● Аутосомно-рецессивное (CRB1, SPATA7)
● Аутосомно-доминантное (Это PRPF3 (человек с PRPF3 является с HPRPF3, а
также с PRP3), PRPF8 , PRPF31 и PAP1)
Частота встречаемости заболевания в популяции 1:5 000. Приблизительно 50000
человек в России, 100000 человек в СНГ, 1,5 млн человек во всем мире страдают
пигментным ретинитом.

18.

норма
Пигментный ретинит

19.

узнавание
Синтез нити
ДНК и ее
встраивание
Лигирование
Hannes Lans, Jurgen A Marteijn and Wim Vermeulen /BioMed Central
Резекция
завершение
процессинга
• Негомологичное соединение
концов (НСК) и
гомологичная рекомбинация
(ГР) в клетках
млекопитающих при
двунитевых разрывах ДНКцепи
Факторы конъюгации
разрывающие/связы
вающие факторы

20.

Снимок мозга
взрослой мыши.
Зеленым
отмечены
нейроны с
отредактированны
м геномом
Salk Institute
https://indicator.ru/imgs/2016/11/18/06/2315/25f2c98ba1c9e0cda7d96e3f241d5f9fcb697485.jpg

21. Дизайнерские дети

В перспективе родители смогут выбрать
не только на здоровье, но и изменять
цвет
глаз,
форму
носа
и
интеллектуальные способности.

22. Выводы

• Технология
CRISPR/Cas9
имеет
больше
перспективы
применения в лечении различных патологий, в том числе и
генетических заболеваний.
• Однако массовое внедрение технологии в клиническую
практику на данный момент невозможно из-за несовершенства
технологии, а также - из-за неоднозначности метода с
этической точки зрения.
• Так или иначе, технологии CRISPR/Cas-9 под силам улучшить
жизнь миллионов людей во всём мире и, возможно,
уничтожить многие генетические заболевания раз и навсегда.

23. СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!

Биохимия
Микробиология
Генетика
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!
Ишанова Диана
Dinok90256@mail.ru
Петухова Анна
annet.057@gmail.com