Морфологические изменения в хрусталике при катаракте

1. Свободные радикалы и болезни человека

Биофизические основы
патологии клетки
Свободные радикалы и болезни человека
Ю.А. Владимиров, А.Н. Осипов
2018

2. Морфологические изменения в хрусталике при катаракте

Морфолог
ическиеиз
менениявхруст
аликепри
кат
аракт
е
В нормальном
хрусталике
глаза клеточные
мембраны не
разрушены
Эпителий
Волокна
Норма
При катаракте
мембраны
разрушены
вследствие
перекисного
Склероз ядра
окисления
липидов Рост эпи
Набух
ание
клето
Разруш
к
ение
мембра
н
Катаракт

3. Повреждение Са-АТФазы

2+
АТФ
Ca
АДФ
АТФ
Ca
Натив
ная CaАТФаз
а
2+
АДФ
Поврежд
енная CaАТФаза

4. Модель слияния плазматических мембран в месте контакта спермия с яйцеклеткой

спермий
яйцеклетка
мицеллы
спермий
яйцеклетка

5. Методы изучения реакций с участием свободных радикалов

6. Методы изучения свободных радикалов

Электронный
парамагнитный резонанс
1. Прямое обнаружение радикалов
Хемилюминесценция
1. Собственная
2. Активированная
2. Метод спиновых ловушек
Биохимические методы
1. Маркеры
2. Диеновая конъюгация
3. ТБК активные продукты
4. Ингибиторный анализ

7.

Метод электронного
парамагнитного резонанса (ЭПР)
• Прямое измерение сигнала радикалов
Сигналы стабильных радикалов
Метод быстрого смешивания
Стабилизация радикалов при низких
температурах
• Метод спиновых ловушек

8. Радиоспектрометр ЭПР

Аттенюатор
Детектор
Источник
микроволнового
излучения
Записывающее
устройство
Усилитель
Микроволновый
резонатор
Магнит
Образец
Магнит
Катушка, модулирующая
поле

9. Прямое обнаружение радикалов липидов методом ЭПР в проточной кювете

LH
O2
Fe2+ + LOOH Fe3+ + LO. L. LOO .
Fe2+
LOH
LOOH
S
Резонатор
Магнит
N
Сигнал ЭПР
Осипов А. Н., Моравский А. П., Шувалов В. Ф.,
Азизова О. А., Владимиров Ю. А. 1980,
Биофизика 25(2): 234-238.

10. Две реакции образования радикалов гидроксила

CH3
CH3
.ОН +
Радикал
гидроксила
C
H
CH3
N
O
N
CH3
OH O
Спиновая ловушка
ФБН
Реакция Фентона
Fe2++ H202 Fe3+ + OH- + HO
.
ФБН + HO• PBN-OH (аддукт)
CH 3
CH
3
Спиновый аддукт
ФБН
Реакция c HOCl
.
Fe2+ + HClO Fe3+ + Cl- + HO
.
.
PBN-OH (аддукт)
ФБН + HO

11. Сигнал ЭПР спиновых аддуктов радикалов олеиновой кислоты, образующихся в реакции ионов Fe2+ с гидроперекисью линоленовой

кислоты
0.30 mT
aN =1,62mT aH= 0,30mT
D H=0,1mT
aN =1,56mT aH = 0,34mT
D H=0,06mT
Fe2+ + LOOH Fe3+ + LO• + OH-
PBN + LO• PBN-LO (аддукт)

12.

Метод хемилюминесценции
• Собственная
• Активированная

13. Современная установка для измерения ХЛ

АналогоЦифровой
Преобразователь
мешалка
кювета
PowerLab
термостат
Светонепроницаемый
кожух
ФЭУ
шторка
Компьютер

14. Кинетика перекисного окисления липидов

40
30
20
10
МВ
СС
ЛП
20
50
Fe2+(мМ); CL (отн. Ед.)
ТБКАП (нмоль/мг белка )
БВ
16
ТБКАП
12
8
4
ХЛ
Fe2+
Fe2+
0
0
3
9
15
21
БВ – быстрая вспышка;
ЛП – латентный период;
МВ – медленная вспышка; СС – стационарное свечение
Владимиров, А., Т.Б. Суслова, В.И. Оленев, Хемилюминесценция, сопряженная с образованием липидных перекисей в биологических
мембранах. П. Роль Fe(2+) в разитии цепного окисления липидов и сверхслабого свечения. Биофизика, 1969. 14: p. 836.

15. Структура производных кумаринов

R
R=
кумарин
C-525
R=
R=
C-314
C-334

16. Биохимические методы изучения свободных радикалов

•Биомаркеры
•Диеновая конъюгация
•ТБК активные продукты
•Ингибиторный анализ

17.

Биомаркеры

18. Биомаркеры

Нуклеиновые
кислоты
de Zwart, L. L.,
Meerman, J. H.,
Commandeur, J. N.
and Vermeulen, N. P.
(1999). Free Radic Biol
Med 26(1-2): 202-26.
Липиды
Белки

19. Маркеры оксидативного повреждения нуклеиновых кислот (слева) и белков (справа)

8-гидроксигуанозин
о-тирозин
тимидингликоль

20. Биомаркеры на окисление арахидоновой кислоты

21. Структура некоторых изопростанов

22. Маркеры липидной пероксидации

Перекисное
окисление
Липоксигеназа
Гидроперекись липида
R
R
Алканы
Коньюгированные диены
O
Альдегиды
a-,b -ненасыщенные
альдегиды
Малоновый
диальдегид
R
O
Алифатические альдегиды
OH
O
R
транс-4-гидроксиалкеналь

23. Биомаркеры - карбонилы

24. Образование изопростановых биомаркеров при отравлении четыреххлористым углеродом

25. Биомаркеры у курильщиков

26.

Диеновая коньюгация

27. Реакции диеновой коньюгации

─ CH2─ CH = CH ─ CH2─ CH = CH ─ CH2 ─
1
─ CH2─ CH = CH ─ CH ─ CH = CH ─ CH2 ─
2
OO
─ CH2─ CH ─ CH = CH ─ CH = CH ─ CH2 ─
3
OO
LH
─ CH2─ CH ─ CH = CH ─ CH = CH ─ CH2 ─
4
OO
─ CH2─ CH ─ CH = CH ─ CH = CH ─ CH2 ─
5
OOH + L

28. Схема образования диеновых коньюгатов

LH + HO
CH
HO
HOH
L
+ O=О
O=O
O-O
LOO

29. Спектр поглощения диеновых коньюгатов

Оптическая плотность
1,0
234 нм
0,5
УФ-облученные
Необлученные
0,0
300
250
Длина волны, нм

30.

Метод с тиобарбитуровой кислотой

31.

Метод ТБК активных продуктов
(TBARS, ThioBarbituric Acid Reactive Substance)
+
Тиобарбитуровая кислота
Малоновый диальдегид
Окрашенный флуоресцирующий продукт,
имеющий поглощение при 532 нм

32.

Ингибиторный анализ

33. Ингибиторный анализ

Источник
радикалов
Детектор
радикалов
Ингибитор
радикалов
Детектор
радикалов
Опыт
Источник
радикалов
Контроль
Ингибиторный анализ

34. Пример 1: обнаружение супероксидных радикалов

Ксантиноксидаза
(генератор супероксида)
Ксантиноксидаза
(генератор супероксида)
Цитохром с
(детектор супероксида)
Цитохром с
(детектор супероксида)
Супероксиддисмутаза
(перехватчик супероксида)

35. Пример 2: обнаружение перекисного окисления липидов

Измерение
диеновых
конъюгатов
Индукторы
ПОЛ
Индукторы
ПОЛ
Антиоксиданты
Измерение
диеновых
конъюгатов