Хроматографические методы анализа и их применение для контроля качества лекарственных средств (продолжение)

1. Хроматографические методы анализа и их применение для контроля качества лекарственных средств (продолжение)

Лекция №6
по курсу «Анализ и контроль
качества лекарственных средств»
1

2. Жидкостная хроматография

• метод разделения, в котором подвижная фаза
представляет собой жидкость, а неподвижная –
твердую или жидкую фазу (не смешивающуюся с
подвижной фазой).
• Различают:
• А. колоночную (низкого и высокого давления – ВЭЖХ
или ЖХВД) и планарную (ТСХ) хроматографии.
• Б. по полярности неподвижной/подвижной фаз и по
механизму удерживания/разделения:
• - прямо-фазовую ЖХ (НФ – полярная, ПФ –
неполярные жидкости)
• - обращенно-фазовую ЖХ (НФ – неполярная или
среднеполярная, ПФ – полярные жидкости).
• - ионообменная или ионная.
• - эксклюзионная (гель-хроматография).
2

3.

3

4. Оборудование (принципиальная схема)

4

5. Варианты проведения ЖХ

• 1. Изократический режим – постоянный состав ПФ в
течение всего анализа (разделение родственных
веществ, мало отличающихся по полярности).
• 2. Градиентный режим – изменяется состав ПФ
(линейный градиент – с постоянной скоростью и
нелинейный градиент – изменение состава с
переменной скоростью) – для разделения веществ,
отличающихся по полярности (например, смесей
водо- и жирорастворимых витаминов), для
повышения эффективности разделения.
5

6. Хроматографические колонки

• Стальные трубки внутренним диаметром 2-5 мм,
длиной 5-30 см, с пористыми фильтрами с обоих
концов. Для защиты аналитической колонки
используются сменные предколонки (длиной 1-2 см).
6

7. Неподвижные фазы

• Общие требования:
• 1. Для обеспечения высокой эффективности
разделения – размер частиц сорбента должен
быть четко установленного размера (1,8 – 10
мкм), четко сферической формы.
• 2. Должен быть устойчивым к повышенному
давлению (нехрупким), к химическим
веществам (устойчивость при рН 2-8) и
температуре (до 60-80оС).
• 3. Обладать высокой удельной поверхностью
(60-300 м2/г) и определенным размером пор
(10-300 нм).
• 4. Обратимая сорбция разделенных
соединений.
7

8. Неподвижные фазы

• Классификация:
• 1. Полярные фазы (для прямофазной ЖХ) –
немодифицированные силикагели,
аминопропилсилилсиликагели, диольные
производные силилсиликагеля, иониты
(HILIC)
Si
OH
O
Si
pH>4
OH
OH
Si
Si
O
O
Si
OH
OH
OH
Si
OH
8

9. Выбор подвижной фазы для нормально-фазовой хроматографии

Выбор подвижной фазы для нормальнофазовой хроматографии
9

10. Неподвижные фазы

2. Среднеполярные фазы (для обращеннофазовой ЖХ) – химически модифицированные
силикагели с привитыми цианопропильными
(СN), пентафторбензильными (PFP),
фенильными (Ph), фенил-гексильными группами.
10

11. Неподвижные фазы

3. Неполярные фазы (для обращеннофазовой ЖХ) – химически
модифицированные силикагели с привитыми
октильными (С8), октадецильными (С18),
фенильными и октадецильными (С18-Ph), и
др.
11

12.

12

13. Принципы разделения

• 1. Полярные фазы –
• 1.1. для разделения неполярных и
малополярных веществ (слабо
адсорбируются НФ) – малополярные
элюенты (гексан (гептан) + низкая доля
полярного растворителя, дихлорметан +
низкая доля полярного растворителя).
• 1.2. для разделения полярных веществ
(сильно адсорбируются НФ) – высокая доля
полярных растворителей (метанол,
ацетонитрил, вода), необходимо
устанавливать рН (от 2 до 9), добавлять
буферный раствор (ионная сила).
13

14. Принципы разделения

• 2. Средне- и неполярные фазы:
• 2.1. Для разделения неполярных веществ
используются ПФ с высоким (40-100%) содержанием
органического растворителя (ацетонитрил, метанол,
тетрагидрофуран).
• 2.2. Для разделения ионизируемых органических
веществ (кислот, оснований, амфолитов, ионов)
необходимо использовать буферные растворы (рН 28 или для ряда колонок – 1-10).
• 2.3. Для разделения органических ионов и
сильнополярных веществ – прибавляют ион-парные
реагенты (алкилсульфонаты, четвертичные
аммониевые соли).
14

15. Механизмы удерживания

15

16. Закономерности удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖХ

Вытеснительная модель удерживания:
1. Из ПФ на поверхности
неполярного/среднеполярного
сорбента адсорбируется органический
компонент (метанол, ацетонитрил).
2. При введении органического
вещества оно вытесняет с поверхности
сорбента часть молекул органического
модификатора. Данный процесс
обратимый и при движении новой
порции ПФ органический модификатор
вновь вытесняет сорбат.
16

17. Влияние рН ПФ и температуры

• На неполярных фазах за счет дисперсионных
взаимодействий лучше удерживаются
неионизированные молекулы. При
ионизации молекул удерживание при прочих
равных условиях уменьшается.
• Температура незначительно влияет на
удерживание органических молекул в водноорганических фазах. При повышении
температуры уменьшается вязкость ПФ и
давление на колонке (возможно работать на
более высоких скоростях ПФ).
17

18. Детекторы в ЖХ

• 1. Детектор спектрофотометрический
(область длин волн – УФ 190-360 нм (дейтериевая
лампа), видимая – 360-900 нм – галогеновая лампа)
– работает при фиксированных длинах волн (от 1 до
10 и более) – двумерная хроматография.
18

19.

• 2. Детектор на основе диодной матрицы –
сканирование оптической плотности элюата в
заданном диапазоне длин волн с большой
скоростью (трехмерная хроматограмма –
время-длина волны-сигнал детектора –
е.о.п.).
19

20. СФ-детектор Детектор на основе диодной матрицы

СФдетектор
Детектор
на основе
диодной
матрицы
20

21. Флуориметрический детектор

• Селективный детектор, основанный на
измерении интенсивности флуоресценции
разделенных веществ (устанавливаются
длины волн возбуждения и эмиссии
(испускания)).
21

22. Рефрактометрический детектор

• Основан на измерении величины
преломления света элюата
(универсальный детектор)
22

23. Электрометрические детекторы

• 1. Амперометрический детектор (детекция
органических веществ, обладающих ОВсвойствами) – может быть комплексный с
ферментативными реакциями.
• 2. Кондуктометический детектор (детекция
ионов, основанная на измерении
проводимости подвижной фазы).
• 3. Кулонометрический детектор.
23

24. Масс-спектрометрическое детектирование

• Универсальный (полный ионный ток) и
селективный (сканирование индивидуальных
масс ионов) детектор
24

25.

25

26. Масс-спектрометрическое детектирование

• 1. Ионизация
образца (ПФ +
разделенные
вещества)
• Принципы:
• 1.1.
электрораспылите
льная (ESI)
26

27.

27

28. Примеры ионизации

N
Inten.(x100,000)
N
217
6.0
N
5.0
N
-
N
H
CN
NC
N
NC
CN
4.0
3.0
2.0
1.0
151
162 172
0.0
150.0
NC
175.0
200.0
275.0
294
300.0
313
330
325.0
3.0
NH
3,0
N
2.0
2,0
1.5
pKBH+=5.5
1,5
1,0
1.0
302,3
239,2
250
263,2
273,3
303,3
314,3
300
341,3
350
396,1
379,1
m/z
N
2.5
N
2,5
H
N
H
N
O
3,5
242.2
Cl
O
0,0
250.0
276
Inten.(x100,000)
261,3
209,4
222,2
225.0
258
3.5
4,0
0,5
242
CN
Inten. (x100,000)
4,5
213
190
0.5
O
N
CH3
CH3
102.0
187.1
200.8
179.3 196.2
122.1 137.1
228.1
164.9
0.0
125.0
150.0
175.0
227.1
200.0
225.0
259.0
245.3
265.1
28
250.0 m/z
349
m/z

29. Масс-спектрометрическое детектирование

• 1.2. Химическая ионизация при атмосферном
давлении:
29

30. 1.3.MALDI (ионизация лазерной десорбцией при взаимодействии с матрицей)

30

31. MALDI-TOF (ионизация лазерной десорбцией при взаимодействии с матрицей и времяпролетным детектированием)

31

32. Масс-анализаторы

• А. непрерывные масс-анализаторы
• 1. Магнитный и электростатический секторный массанализатор (Sector)
• 2. Квадрупольный масс-анализатор (Quadrupole mass
analyzer)
• Б. импульсные масс-анализаторы
• 1. Времяпролётный масс-анализатор (Time-of-flight mass
spectrometry)
• 2. Ионная ловушка (Ion trap)
• 3. Квадрупольная линейная ловушка (Quadrupole ion trap)
• 4. Масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с
Фурье-преобразованием (Fourier transform ion cyclotron
resonance)
• 5. Орбитрэп (Orbitrap)
32

33. Масс-спектрометрическое детектирование

• Достоинства:
• 1. Высочайшая чувствительность органических веществ,
биополимеров (10-15 г/пробе).
• 2. Высокая специфичность детекции (последовательная массспектрометрия (дочерних ионов)).
• 3. Метод сбора информации о структуре молекул (точность
установления молярных масс – до 0,0001-0,000001 а.е.м.).
• 4. Широкий линейный диапазон – 106-107.
• 5. Наличие баз данных по масс-спектрам огромного числа
органических веществ (для ГХ/МС).
• 6. Основной детектор при проведении биоэквивалентных
испытаний, допинг-контроля, судебно-химической экспертизы,
исследования метаболизма, генеза БАВ и др.
• Недостатки:
• 1. Сложность и высокая стоимость оборудования и расходных
материалов.
• 2. Необходимо дополнительное обучение непосредственно массспектрометрии и интерпретации спектров.
33

34. Сравнение различных типов детекторов

34

35. Применение ВЭЖХ в фармацевтическом анализе

• 1. Идентификация веществ
• 1.1. Сравнение времен удерживания со
стандартным веществом
DAD1 A, Sig=254,8 Ref=360,100 (D:\AGILENT\DATA\IMMUNOBEX\010613_OPS\IMUNOBEX 2013-06-27 11-58-54\TS1_.D)
400
10.984 - 4-acetamidobenzoic acid
mAU
Испытуемый
раствор
350
300
mAU
250
Раствор
сравнения
200
300
3.620 - inosine
150
100
250
50
10.984 - 4-acetamidobenzoic acid
350
200
0
2
4
6
8
10
12
14
150
min
3.620 - inosine
0
100
50
35
0
0
2
4
6
8
10
12
14
min

36. Применение ВЭЖХ в фармацевтическом анализе

• 1.2. Идентификация по времена
удерживания и спектрам поглощения
пиков.
DAD1, 3.611(376mAU,Apx) of RSO3_.D
mAU
mAU
80
10.984 - 4-acetamidobenzoic acid
350
300
250
60
40
20
200
0
150
3.620 - inosine
220
100
240
260
280
300
320
340
nm
DAD1, 10.991 (967 mAU,Apx) of RSO3_.D
mAU
50
800
0
0
2
4
6
8
10
12
14
min
600
400
200
36
0
200
220
240
260
280
300
320
340
nm

37. Применение ВЭЖХ в фармацевтическом анализе

• 1.3. Идентификация веществ (образцов) по
хроматографическому профилю (наличие
определенного числа пиков с относительными
временами удерживания по любому из компонентов)
– растительные экстракты, ЛС сложного состава.
Norm.
120
100
80
60
40
20
37
0
0
10
20
30
40
50
min

38. Применение ВЭЖХ в фармацевтическом анализе

• 2. Определение специфических (родственных) примесей –
полуколичественный анализ
• 2.1. По стандартному образцу примеси
38

39. 2. Определение специфических (родственных) примесей – полуколичественный анализ

• 2.2. По стандартному раствору основного
вещества, разведенному до определенного
предела (0,05-5%).
39

40. 2. Определение специфических (родственных) примесей – полуколичественный анализ

• 2.3. Методом внутренней нормализации
D at af ile N am e: t s _t s _06. 02. 2013_001. lc d
Sam ple N am e: t s
2,25
mAU
237nm4nm (1,00)
2,00
1,75
1,50
1,25
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
-0,25
-0,50
-0,75
-1,00
16.840
Norm.
140
15,0
120
20,0
25,0
30,0
35,0
min
100
80
60
40
20
40
30.663
10,0
24.401
5,0
7.607
-1,75
29.325
-1,50
27.934
-1,25
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min

41. Определение специфических (родственных) примесей

• 2.4. Количественное
определение (например,
токсичные примеси) –
методом градуировочного
графика
41

42. 2.5. Определение энантиомерной чистоты

42

43. Применение ВЭЖХ в фармацевтическом анализе

• 3. Определение основных показателей готовых
лекарственных средств – однородность
дозированных единиц, тест «Растворение»,
количественное определение стабилизаторов,
консервантов, красителей и др.
• 4. Определение пластификаторов в упаковочных
материалах.
• 5. Определение остаточных количеств пестицидов
(гербицидов, инсектицидов) в ЛРС, продуктах из
ЛРС.
• 6. Определение остаточных количеств активных
фармацевтических ингредиентов на
оборудовании (контроль отмывки оборудования),
в сточных водах.
43

44. Капиллярный электрофорез

• Метод капиллярного электрофореза (КЭ) основан на
разделении заряженных компонентов сложной смеси в
кварцевом капилляре под действием приложенного
электрического поля за счёт подачи высокого
напряжения к концам капилляра.
• Наиболее распространёнными вариантами метода КЭ
являются: 1 капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ)
• 2. мицеллярная электрокинетическая хроматография
(МЭКХ).
• КЗЭ - метод разделения, реализуемый в капиллярах и
основанный на различии в электрокинетических
подвижностях заряженных частиц как в водных, так и в
неводных электролитах.
44

45. Капиллярный электрофорез

МЭКХ - вариант капиллярного электрофореза, который
позволяет проводить разделение соединений ионного и
нейтрального характера при использовании ПАВ. Разделение
электро-нейтральных соединений осуществляется благодаря
введению в состав ведущего электролита поверхностноактивных веществ - мицеллообразователей. Чаще всего
используют анионный ПАВ (например, ДДС) в концентрациях,
превышающих критическую концентрацию мицелообразования,
что приводит к формированию так называемой
«псевдостационарной фазы», и аналиты распределяются
между мицеллой и буферным электролитом согласно их
гидрофобности.
45

46.

После подачи к концам капилляра высокого напряжения (до 30
кВ), компоненты смеси начинают двигаться по капилляру с
разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда и
величины ионного радиуса и, соответственно, в разное время
достигают зоны детектирования. Полученная
последовательность пиков называется
электрофореграммой, при этом качественной
характеристикой вещества является параметр удерживания
(время миграции), а количественной – высота или площадь
пика, пропорциональная концентрации вещества.
46

47. Основные параметры КЭ

1. Время миграции (tм) - время, необходимое компоненту для
прохождения им эффективной длины капилляра (Lэфф) от зоны ввода
пробы (начала капилляра) до зоны детектирования;
2. Электроосмотический поток (ЭОП) - течение жидкости в
капилляре под действием приложенного электрического поля.
Время, необходимое жидкости для преодоления эффективной
длины капилляра вследствие возникающего ЭОП, называют
временем ЭОП (tэоп) и экспериментально определяют из
электрофореграммы по времени миграции нейтрального компонента
– маркера ЭОП.
3. Подвижность ЭОП (μэоп) - представляет собой отношение
скорости ЭОП к напряженности электрического поля. Скорость ЭОП
положительна при направлении движения жидкости от входного
участка капилляра к детектору и отрицательна при обратном
направлении. В свою очередь, скорость ЭОП вычисляют по
формуле:
νэоп= Lэфф / tэоп.
47

48.

48

49. Механизм ЭОП

49

50. Электроосмотический поток

• Уникальной особенностью ЭОП является плоский
профиль потока в капилляре. Такой профиль выгоден,
поскольку уменьшается размывание зон разделяемых
веществ. Следует отметить, что эффективность разделения
в капиллярном электрофорезе прямо пропорциональна, а
время анализа – обратно пропорционально напряжению,
приложенному к электродам. Разделение в КЭ может быть
выполнено как с положительной, так и отрицательной
полярностью электродов. Зная значения рКа для
компонентов пробы, можно выбрать буфер с подходящим
значением рН и полярность электродов, чтобы образец
двигался в сторону детектора. Скорость миграции зависит
от напряженности электрического поля, которая обычно
составляет 200-400 В/см.
50

51. Капилляры для разделения

Подавляющее большинство разделений в КЭ проводят с
использованием кварцевых капилляров имеющих внешнее
полимерное покрытие, обычно - полиимидное, улучшающее их
механическую прочность, и значительно реже полимерные
капилляры, например из тефлона. Внутренний диаметр
капилляров колеблется в пределах от 25 до 200 микрон, а длина
капилляра в зависимости от поставленной задачи – от
нескольких сантиметров до 1 метра. Поскольку внешнее
полиимидное покрытие непрозрачно в УФ-области, то участок
покрытия удаляют и создают окно для УФ-детектирования.
Капилляр закрепляется в специальной пластиковой кассете.
Надежное термостатирование капилляра является основным
условием получения воспроизводимых времен миграции
определяемого соединения и площади результирующего пика,
что важно для количественного анализа. Используют капилляры
с внутренним диаметром 25-50 мкм, что является
компромиссным решением между достаточно высокой
51
чувствительностью и эффективностью разделения.

52. Ввод образца

Проба может быть введена в капилляр электрофоретическим,
электрокинетическим или вытеснительным способом. Объем вводимой
пробы не превышает 2 нл, относительное стандартное отклонение
составляет 0,03-0,04. При электрофоретическом вводе пробы, к концам
капилляра прикладывается высокое напряжение на фиксированный
промежуток времени, при этом входной конец капилляра погружают в
раствор пробы. Ионы пробы перемещаются в капилляр пропорционально их
электрофоретической подвижности. В случае электрокинетического ввода,
компоненты пробы попадают в капилляр за счет комбинации
электроэндоосмотического давления и электрофоретической подвижности.
Вытеснительный ввод пробы достигается либо за счет создания
избыточного внешнего давления инертного газа, приложенного к резервуару
с образцом, либо за счет создания вакуума на выходе из капилляра или
путем изменения уровня/высоты резервуара, содержащего образец,
относительно резервуара с буферным раствором на выходе из капилляра
(так называемое гравитационное введение пробы).
52

53. Детектирование

Детектирова
ние
53

54. Пример разделения неорганических ионов (КЭ)

• 1 – хлорид; 2 – нитрит; 3 –
• сульфат; 4 – нитрат; 5 – фторид; 6 – гидрофосфат; 7 –
гидрокарбонат;
54

55.

55

56. Термические методы анализа

• Основаны на установлении зависимостей различных
физических или физико-химических свойств веществ
от температуры (градиента температуры).
• А – Термогравиметрия
• Б – Дифференциальный термический
анализ
• В – Дифференциальная сканирующая
калориметрия
56

57.

57

58.

58

59.

59

60.

60

61.

61

62.

62

63.

63

64.

64

65.

65

66.

66

67.

67

68.

68

69. БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!

69