Структурная организация биополимеров. ДНК и РНК

1.

Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия: В 3-х т. Пер. с
англ. - М.: Мир, 1984. - Т. 1 - 336 с.,ил.
Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия: в 3-х т. Пер. с
англ. - М.: Мир, 1984. - Т. 2 - 496 с.,ил.
Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия: в 3-х т. Пер. с
англ. - М.: Мир, 1985. - Т. 3 - 536 с.,ил.
Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. Пер. с англ.
- М.: Мир, 1985. - Т. 1 - 367 с.,ил.
Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. Пер. с англ.
- М.: Мир, 1985. - Т. 2 - 368 с.,ил.
Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. Пер. с англ.
- М.: Мир, 1985. - Т. 3 - 320 с.,ил.

2.

Биополимеры
Нуклеиновые кислоты
Полисахариды
Белки

3.

Nucleus
Фридрих Мишер
1844—1895
Феликс Хопп-Зейлер
1825—1895
Первые из известных
изображений клеточных ядер.
А.Левенгук (1632 – 1723 ), 1719
1869 (1871)

4.

Уровни структурной организации биополимеров
Первичная структура –
полная ковалентная структура молекулы
Вторичная структура – совокупность спиральных участков молекулы (не
зависящая от состава мономеров).
Белки – водородные связи.
Нуклеиновые кислоты – водородные связи (уотсон-криковские пары),
стэкинг-взаимодействия.
Третичная структура – полная трехмерная структура молекулы (зависящая
от состава мономеров)
Белки – все виды связей.
Нуклеиновые кислоты – водородные связи (не уотсон-криковские пары).
Четвертичная структура – пространственное расположение не связанных
ковалентно единиц третичной структуры (нековалентные связи).

5.

Первичная структура
Последовательность мономеров…
R1-R2-R3-R4-R5-…
соединенных по принципу «голова к хвосту»
Ra-Rb
Rb-Ra

6.

ДНК
Первичная структура

7.

Первичная структура ДНК
Азотистые основания
N
1
2
6
3
N
5
7
4
9
N
8
2
N
H
N
H 2N
N
Гуанин
6
1
O
NH2
N
H
5
Пиримидин
O
N
4
N
Пурин
HN
3
N
N
N
Аденин
N
H
NH2
HN
O
N
N
H
Тимин
O
N
H
Цитозин

8.

Первичная структура ДНК
Дезоксирибоза
Нуклеозиды
(β-N-гликозиды)
NH2
O
N
N
5
HO
HO
H
O
4
H
H
3
OH
2
H
H
5’
4’
1
OH
N
N
NH2
HO
O
H
H
OH
H
3’ 2’
H
N
NH
1’
5’
4’
H
O
3’ 2’H 1’
H
H
Дезоксигуанозин
OH
H
H
Дезоксицитидин
O
NH2
N
N
HO
5’
4’
H
NH
N
N
N
HO
O
H
H
3’ 2’
OH
H
O
1’
H
Дезоксиаденозин
5’
4’
H
O
O
3’ 2’H 1’
H
OH
H
H
Дезокситимидин

9.

Первичная структура ДНК
Нуклеотиды - фосфорные эфиры нуклеозидов
NH2
N
Эфиры ортофосфорной кислоты
нуклеозидмонофосфаты
O
-
O
P
O
N
5’
O
N
O
-
Дезоксиаденозин-5’-монофосфат
N
H
H
H
OH
H
H
NH2
N
Эфиры пирофосфорной кислоты
нуклеозиддифосфаты
O
-
O
O
P
O
O
-
N
5’
P
O
O
N
O
-
Дезоксиаденозин-5’-дифосфат
N
H
H
H
OH
H
H
NH2
N
Эфиры триполифосфорной кислоты
нуклеозидтрифосфаты
O
-
O
O
P
O
O
-
O
P
O
O
-
Дезоксиаденозин-5’-трифосфат
P
O
N
5’
O
O
-
H
H
H
OH
H
H
N
N

10.

Первичная структура ДНК
Нуклеотиды - фосфорные эфиры нуклеозидов
NH2
N
Эфиры ортофосфорной кислоты
нуклеозидмонофосфаты
N
N
HO
Дезоксиаденозин-3’-монофосфат
N
O
H
H
O
O
H
3’
H
H
O-
P
NH2
N
N
ON
HO
O
H
Эфиры пирофосфорной кислоты
нуклеозиддифосфаты
Дезоксиаденозин-3’-дифосфат
N
H
O
O
H
3’
P
O
H
NH2
H
N
N
O
O
P
O-
HO
O
H
OH
O
Эфиры триполифосфорной кислоты
нуклеозидтрифосфаты
Дезоксиаденозин-3’-трифосфат
N
-
O
H
3’
P
O-
O
O
P
O-
O
O
P
O-
O-
H
H
N

11.

Первичная структура ДНК
Физические свойства нуклеотидов
Основание
Аденин
Гуанин
Цитозин
Тимин
Максисмум
УФ-поглощения, нм
260
245
268
265
Поглощение в УФ
области
дезоксирибозы
и дезоксирибозо-5фосфата
Ito A., Ito T. Photochem Photobiol. 1986
44(3):355-8.

12.

Первичная структура ДНК
Динуклеотиды
NpN
NH2
NH2
N
N
-
N
O
5’ -O
P
O
O
H
OH
O
O
H
O
N
H
H
O
H
P
O
H
N
O
O
N
O
H
O
H
OH
H
H
H
H
OH
H
O
H
P
H
N
O
O
O
-
H
O
H
H
O
H
P
H
O-
O-
5’-ApCp-3’
H
NH2
N
3’
-
O
P
N
N
O
5’-pApC-3’
H
H
O
O-
N
H
O
5’-pApC-3’
NH2
N
O
O
O
H
-
H
H
HO
N
H
N
N
NH2
N
O
-
H
O
P
P
O
NH2
N
O
N
N
N
O
N
NH2
O
NH2
N
O
H
OH
O
5’-pApCp-3’
N
H
O
P
H
H
N
O
O
-
O
H
O
H
H
O
H
P
O-
O-
H
O

13.

Первичная структура ДНК
Олигонуклеотиды и полинуклеотиды
NpNpNpNpN…
NH2
N
N
O
5’
-
O
P
O
O
5’
P
N
NH2
N
O
H
-
H
O
N
P
H
O
P
P
H
H
N
O
O
H
OH
O
P
O
O
O
P
N
NH
H
H
H
N
O
O
N
NH2
O
OH
O
H
O
H
H
N
O
O
H
O
H
O
H
P
O
H
N
O
H
H
H
OH
H
3’
O
ACGTC
O
-
T
C
5’-pApCpGpTpC-3’
N
H
G
NH2
O
O-
C
3’
NH
H
P
P
A
H

14.

Первичная структура ДНК
Сахарофосфатный
остов
Азотистые
основания
5’
Однобуквенные обозначения
A - аденин
T - тимидин
G - гуанин
C - цитозин
R - пурин (А/G)
Y - пиримидин (T/C)
M - содержащие аминогруппу (A/C)
K - содержащие кетогруппу (G/T)
W - образующие 2 водородные связи (A/T)
S - образующие 3 водородные связи (G/C)
N - любой
3’

15.

16.

ДНК
Вторичная структура

17.

Вторичная структура ДНК
Стэкинг-взаимодействия

18.

Вторичная структура ДНК
Стэкинг-взаимодействия

19.

Вторичная структура ДНК
Стэкинг-взаимодействия
Ориентационное взаимодействие
взаимодействие между
постоянными диполями (сила Кеезома [r3])
Индукционное взаимодействие
взаимодействие между
постоянным и индуцированным диполем (сила Дебая [r6])
Дисперсионное взаимодействие
взаимодействие между
мгновенными индуцированными диполями (сила Лондона [r6])
Межмолекулярное отталкивание ([r12])

20.

Вторичная структура ДНК
Стэкинг-взаимодействия
http://www.slideshare.net/katsuyama/computational-organic-chemistry
Пиррол
Пиридин
Имидазол

21.

Вторичная структура ДНК
Стэкинг-взаимодействия
http://slideplayer.com/slide/9396582/
Пиримидин
http://slideplayer.com/slide/8380330/
Пурин

22.

Вторичная структура ДНК
Стэкинг-взаимодействия
NH2
O
N
HN
N
H
H 2N
N
N
H
NH2
N
H
N
HN
N
N
N
O
O
O
N
H
Lucas X. et al. Chemical Science 2015, 7, 1038
Аденин
Гуанин
Цитозин
Урацил

23.

Вторичная структура ДНК
Водородные связи
Т
А
А
Т
Shishkin O.V. et al. Int. J. Mol. Sci. 2003, 4(10), 537-547

24.

Вторичная структура ДНК
Водородные связи
Пары оснований
CH3
2.85Å
H
Тимин
O
H
H
N
N
N
2.90Å
H
СФО
Аденин
N
N
H
O
H
H
СФО
H
ЦитозинH
N
H
2.83Å
O
N 2.86Å
H
N
N
СФО
O
N
N
Гуанин
N
H
2.84Å
H
N
H
N
N
СФО

25.

Вторичная структура ДНК
Две антипараллельные нити,
стабилизированные водородными связями
5’
P
P
P
P
P
3’
3’
A
T
C
G
G
C
T
A
C
G
P
P
P
P
P
5’

26.

Вторичная структура ДНК
Условные обозначения
5’
P
P
P
P
P
3’
A
C
G
T
C
5’
P
P
P
P
P
3’
A
T
C
G
G
C
T
A
C
G
3’
5’
3’
3’
5’
P
P
P
P
P
5’

27.

Вторичная структура ДНК
Принцип комплементарности
Правила Чаргаффа
1. А=Т, Г=Ц
2. R=Y
3. M=K
Пары оснований
CH3
2.85Å
H
Тимин
O
H
H
N
N
N
2.90Å
H
СФО
Аденин
N
N
H
O
H
H
СФО
H
ЦитозинH
N
H
2.83Å
O
N 2.86Å
H
N
N
СФО
O
N
N
Гуанин
N
H
2.84Å
H
N
H
N
N
СФО

28.

Вторичная структура ДНК
Принцип комплементарности

29.

Вторичная структура ДНК
Конформации нуклеозидов
NH2
O
N
N
NH
N
N
N
HO
NH2
HO
O
O
H
H
H
OH
H
H
H
H
H
OH
H
Анти
H
Анти
NH2
O
N
HN
H2N
O
N
N
N
N
O
HO
HO
O
O
H
H
H
OH
H
Син
H
H
H
H
OH
H
Син
H

30.

Вторичная структура ДНК
Конформации фуранозного кольца
АО
АО
2’
5’
5’
4’
5
HO
4
H
H
3
OH
2
H
H
1’
4’
1’
3’
3’
H
O
O
O
C2’-эндо
(В-ДНК)
1
2’
C2’-экзо
OH
АО
АО
3’
5’
5’
O
4’
4’
2’
C3’-эндо
(А-ДНК)
O
2’
1’
3’
C3’-экзо
1’

31.

Вторичная структура ДНК
Конформации пары оснований
Геометрия пары оснований

32.

Основные параметры спирали
Спираль
z
13
12
11
8
9
δ
10
7
6
Р – шаг спирали
r – радиус спирали (диаметр d = r • 2)
δ – угол спирального вращения
z0 – расстояние между звеньями
вдоль оси Z
P
5
4
3
z0
1
2
r
y
x

33.

Вторичная структура ДНК
Двойная спираль ДНК
A-ДНК
B-ДНК
Z-ДНК
http://www.digitaljournal.com

34.

Вторичная структура ДНК
Двойная спираль ДНК
B-ДНК
A-ДНК
A-ДНК
B-ДНК
Z-ДНК

35.

Вторичная структура ДНК
Двойная спираль ДНК
Сахарофосфатный
остов
NH2
N
5’
N
O
-
O
P
O
N
O
NH2
N
O
-
H
O
N
H
H
O
H
P
O
H
N
O
O
O
O
-
H
O
N
H
H
O
H
P
H
NH
N
O
O
N
NH2
O
OH
O
NH
H
H
O
H
N
O
P
O
H
O
NH2
O
-
H
O
N
H
H
O
H
P
O
H
N
O
O
-
H
H
H
OH
H
3’
H
O
Азотистые
основания

36.

Вторичная структура ДНК
Двойная спираль ДНК
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
+
3’

37.

Вторичная структура ДНК
Двойная спираль ДНК
B-ДНК
Сахарофосфатный остов
~10.5 п.н.
Азотистые основания

38.

Вторичная структура ДНК
Параметры двойных спиралей ДНК
Параметр
A-ДНК
B-ДНК
Z-ДНК
Правая
Правая
Левая
Широкая, сплюснутая
Релаксированная
Удлиненная, утонченная
1 пара нуклеотидов
1 пара нуклеотидов
2 пары нуклеотидов
11
10.4
12
+33.6°
+35.9°
-30°
Уклон
+19°
~ 0°
-9°
Пропеллер
+18°
+16°
0°
Расстояние между звеньями вдоль оси (z0)
0.24 нм
0.34 нм
0.37 нм
Шаг спирали (P)
2.5 нм
3.5 нм
4.6 нм
Анти
Анти
Ц – анти
Г - син
Конформация фуранозного кольца
C3’-эндо
C2’-эндо
Ц - C2’- эндо
Г - C3’- эндо
Диаметр спирали (d)
~ 2.6 нм
~ 2.0 нм
~ 1.8 нм
Узкий глубокий
Широкий глубокий
Плоский неглубокий
Широкий неглубокий
Узкий глубокий
Очень узкий глубокий
Поли-А, шпильки ДНК,
гибрид ДНК-РНК, спираль РНК-РНК
Основная форма ДНК
Поли-ГЦ
Спираль
Форма
Повторяющаяся единица
Количество нуклеотидов на шаг спирали
Угол спирального вращения (δ)
Конформация нуклеозида
Большой желобок
Малый желобок
Примеры

39.

Вторичная структура нуклеиновых кислот
Шпильки, стебельки, узелки
Шпилька
Псевдоузел
Петля на стебле
(стебель-петля)

40.

Вторичная структура ДНК
Палиндромы (АРГЕНТИНАМАНИТНЕГРА)
5’
3’
T А
A T
А
T
Т G
A C
5’
3’
T C
A G
T А
A T
T A
A T
T
C
T
G
Т
А
T
A
C
A
G
A
A
T
G G
C C
G
G
A
C
A
T
A
T
G
T
C
C
C G
G C
A
T
C A
G T
3’
5’
T C G
A G C
3’
5’

41.

Вторичная структура ДНК
Палиндромы
Неправильное спаривание
5’
T
А
А
Т
G
T
C
T
A
G G
A
+
3’
A
G C
T
T
C
T
G
Т
А
A
5’
G
G
A
C
A
T
5’
T
А
C
G
3’
3’
A
T
G C
5’
C
A
T
C
G
3’

42.

43.

Вторичная структура ДНК
Плавление (денатурация) ДНК

44.

Вторичная структура ДНК
Плавление ДНК

45.

Вторичная структура ДНК
Плавление (денатурация) ДНК
Tm – температура плавления (m = “melting”)
Зависимость температуры
плавления от GC состава ДНК

46.

Вторичная структура ДНК
Плавление (денатурация) ДНК
Олигонуклеотид
Инозин
Синтетический олигонуклеотид с
нестабильными концами
Цитозин
2-Аминоаденин
O
H2N
NH2
N
HN
N
Тимин
N
H
N
N
N
N
H
Синтетический олигонуклеотид
со стабильными концами

47.

Вторичная структура ДНК
Плавление (денатурация) ДНК
T (°C)
+
NaOH
Локальное плавление
Разделение
цепей

48.

Вторичная структура ДНК
Плавление (денатурация) ДНК
ДНК из локуса рибосомных генов, частично
денатурированная щелочью
(очищенная электронная микрофотография)

49.

Вторичная структура ДНК
Реассоциация (ренатурация) ДНК
Нуклеация
Рост 2-цепочечного
участка
Схлопывание
цепей

50.

Вторичная структура ДНК
Реассоциация (ренатурация) ДНК
Нуклеация
Рост 2-цепочечного
участка

51.

Вторичная структура ДНК
Реассоциация (ренатурация) ДНК
Результат быстрого охлаждения ДНК
после денатурации

52.

Вторичная структура ДНК
Реассоциация (ренатурация) ДНК
ATTGCGGTCATGTAGCG
+
TAACGCCAGTACATCGC
ATTGCGGTCATGTAGCG
TAACGCCAGTACATCGC
ATTGCGGTCATGTAGCG
TAACGCCAGTACATCGC
ATTGCGGTCATGTAGCG
TAACGCCAGTACATCGC
ATTGCGGTCATGTAGCG
TAACGCCAGTACATCGC
ATTGCGGTCATGTAGCG
TAACGCCAGTACATCGC
ATTGCGGTCATGTAGCG
TAACGCCAGTACATCGC
ATTGCGGTCATGTAGCG
TAACGCCAGTACATCGC
ATTGCGGTCATGTAGCG
TAACGCCAGTACATCGC

53.

Вторичная структура ДНК
Реассоциация (ренатурация) ДНК
AAAAAAAAAAAAAAAAA
+
TTTTTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTT
2L + 1
вариантов …
AAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTT
… + липкие концы
AAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTT

54.

Вторичная структура ДНК
Схлопывание
к
ле
и
шп
е
к
ни
ле
ва
и
о
з
шп
ра
д
б
а
О
сп
е
а
ан и
Р
в
ы
оп
Схл
н ых
ч
е
ч
о
-цеп ов
1
т
Рос участк
Неправильное
спаривание
Разделение
цепей
Разделение
цепей
Ра
с
па
дш
О
Нукле- бр
пи
азо
ле
к
ация
ван
ие
шп
ил
ек
Ра
сп
Об
ад
ра
шп
зо
ил
ва
ек
ни
еш
пи
ле
Образов
к
ание шп
илек
Распад
шпилек
Структуры ДНК при температурах, близких к Тm
Схлопывание
Схлопывание
Нуклеация
Слияние петель
Рост 1-цепочечных
участков
Локальное плавление
(образование петель)
Разделение
цепей
Реассоциация (ренатурация) ДНК

55.

Вторичная структура ДНК
Реассоциация (ренатурация) ДНК
Отжиг– нагрев и медленное охлаждение
Ta – температура отжига (a = “annealing”)
Ta ≈ Tm – 5 (°C)

56.

57.

Вторичная структура ДНК
Гибкость ДНК
В растворе молекула ДНК представляет собой хаотичный клубок

58.

Вторичная структура ДНК
Шаг пары оснований
0.34 нм

59.

Вторичная структура ДНК
Конформации шага пары оснований
сдвиг
скольжение выпячивание
смещения
кручение
вращения
качание
изгиб

60.

Вторичная структура ДНК
Конформационная подвижность шага пар оснований
Конформационные диапазоны
шагов пар оснований
сдвиг
скольжение выпячивание
кручение
качание
изгиб

61.

Вторичная структура ДНК
Подвижность шага пар оснований
3’
3’
Г
Шаг С-G
5’
Ц
3’
5’
3’
Ц
Шаг G-C
Г
5’
5’

62.

Вторичная структура ДНК
Электронная конфигурация пар оснований
А
Т
G
C

63.

Вторичная структура ДНК
Электронные конфигурации шагов пар оснований

64.

Вторичная структура ДНК
Гибкость разных последовательностей ДНК
AAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTT
GGGGGGGGGGGGGGGGG
CCCCCCCCCCCCCCCCC
AGCTTGACTAGTCATCA
TCGAACTGATCAGTAGT

65.

66.

РНК
Первичная структура

67.

Первичная структура РНК
Азотистые основания
N
1
2
6
3
N
5
7
4
9
N
8
2
N
H
N
H 2N
N
Гуанин
6
1
O
NH2
N
H
5
Пиримидин
O
N
4
N
Пурин
HN
3
N
N
N
Аденин
N
H
NH2
HN
O
N
N
H
O
O
Урацил
HN
O
N
H
Тимин
N
H
Цитозин

68.

Первичная структура РНК
Различия в биологических свойствах урацила и тимина
ДНК
РНК
O
O
HN
O
HN
N
H
Тимин
(5-метилурацил)
O
N
H
Ядро
Урацил
РНК
ДНК
Цитоплазма

69.

Первичная структура РНК
Различия в биологических свойствах урацила и тимина
NH2
O
H2O
NH3
HN
N
O
AUUGCUCGAUGCUUCGUUAGU
UAACGAGCUACGAAGCAAUCA
N
H
Цитозин
O
N
H
AUUGCUCGAUGCUUUGUUAGU
UAACGAGCUACGAAGCAAUCA
AUUGCUCGAUGCUUUGUUAGU
UAACGAGCUACGAAACAAUCA
AUUGCUCGAUGCUUCGUUAGU
UAACGAGCUACGAAGCAAUCA
ATTGCTCGATGCTTCGTTAGT
TAACGAGCTACGAAGCAATCA
ATTGCTCGATGCTTUGTTAGT
TAACGAGCTACGAAGCAATCA
ATTGCTCGATGCTTCGTTAGT
TAACGAGCTACGAAGCAATCA

70.

Первичная структура РНК
Рибоза
Нуклеозиды
(β-N-гликозиды)
O
N
N
5
HO
HO
H
O
4
H
H
3
2
H
5’
4’
1
N
H
O
H
H
OH
H
H
OH
H
OH
H
N
5’
4’
N
HO
5’
3’ 2’H 1’
H
H
H
OH
OH
Цитидин
H
O
N
NH
N
N
HO
3’ 2’H 1’
OH
5’
O
H
H
OH
Аденозин
O
O
NH2
4’
OH
NH2
1’
H
N
HO
N
Гуанозин
OH
OH
OH
NH
HO
O
3’ 2’
H
NH2
4’
O
3’ 2’H 1’
H
H
OH
H
OH
Уридин
O

71.

Первичная структура РНК
Нуклеотиды - фосфорные эфиры нуклеозидов
NH2
N
Эфиры ортофосфорной кислоты
нуклеозидмонофосфаты
O
-
O
P
O
N
5’
O
N
O
-
Аденозин-5’-монофосфат (АМФ)
N
H
H
H
OH
H
OH
NH2
N
Эфиры пирофосфорной кислоты
нуклеозиддифосфаты
O
-
O
O
P
O
O
-
P
O
N
5’
O
N
O
-
Аденозин-5’-дифосфат (АДФ)
N
H
H
H
OH
H
OH
NH2
N
Эфиры триполифосфорной кислоты
нуклеозидтрифосфаты
O
-
O
O
P
O
O
-
O
P
O
O
-
Аденозин-5’-трифосфат (АТФ)
P
O
N
5’
O
O
-
H
H
H
OH
H
OH
N
N

72.

Первичная структура РНК
Нуклеотиды - фосфорные эфиры нуклеозидов
NH2
N
Эфиры ортофосфорной кислоты
нуклеозидмонофосфаты
N
N
HO
Аденозин-3’-монофосфат
N
O
H
H
O
O
H
H
OH
3’
O-
P
NH2
N
N
ON
HO
Эфиры пирофосфорной кислоты
нуклеозиддифосфаты
Аденозин-3’-дифосфат
N
O
H
O
H
H
O
H
OH
P
3’
O
NH2
N
N
O
O
O-
P
HO
O
H
-
O
H
O
Эфиры триполифосфорной кислоты
нуклеозидтрифосфаты
Аденозин-3’-трифосфат
N
-
O
H
3’
P
O-
O
O
P
O-
O
O
P
O-
O-
H
OH
N

73.

Первичная структура РНК
цАМФ
аденозин-3’,5’-цикломонофосфат
3’,5’-цикло-АМФ

74.

Первичная структура РНК
Олигонуклеотиды и полинуклеотиды
NpNpNpNpN…
NH2
N
5’
-
O
P
O
N
N
O
5’
P
P
O
N
N
O
NH
O
H
-
H
O
H
NH2
N
H
OH
O
P
N
P
O
O
OH
O
P
NH2
H
O
H
OH
P
N
O
O
O
H
O
H
O
H
OH
O
U
NH
H
P
C
O
O
-
G
3’
N
H
A
N
O
O
5’-pApGpCpU-3’
O
-
H
H
H
OH
H
OH
3’
AGCU

75.

Первичная структура РНК
Сахарофосфатный
остов
Азотистые
основания
5’
3’

76.

РНК
Вторичная структура

77.

Вторичная структура РНК
Конформации фуранозного кольца
АО
АО
2’
5’
5’
4’
HO
H
O
4
H3
H
1’
4’
OH
H
2
1’
3’
3’
5
O
O
C2’-эндо
1
2’
C2’-экзо
(РНК в мономерной форме)
H
OH
АО
АО
3’
5’
4’
5’
O
O
4’
2’
2’
1’
C3’-эндо
(РНК в мономерной форме
и в двойной спирали)
3’
C3’-экзо
1’

78.

Вторичная структура РНК
Внутрицепочечные шпильки
Псевдоузел
16S рРНК
тРНК

79.

80.

Нестандартные вторичные
и третичная структура
нуклеиновых кислот

81.

Уотсон-криковские пары

82.

Хугстиновские пары
Уотсон-криковские пары
Хугстиновские пары

83.

Триплекс в большом желобке

84.

Триплекс в большом желобке
РНК Теломеразы

85.

Квадруплекс
Теломерная ДНК

86.

Третичная структура РНК
Целующиеся петли
Транспортная РНК

87.

Третичная структура РНК
Триплекс в малом желобке
(водородные связи между азотистым основанием и малой бороздкой)
Самосплайсирующиеся рибозимы

88.

Третичная структура РНК
Триплекс в малом желобке
Мотив «ля-минор» (A-minor motif)
(водородные связи между аденином и малой бороздкой)
Транспортная РНК

89.

Третичная структура РНК
Рибозная «застежка-молния»
(водородные связи между OH группами у С2’ атома рибозы)
Рибосомальная РНК

90.

Третичная структура РНК
Третичная структура тРНК
Целующиеся петли
Мотив A-minor

91.

92.

Методы исследования
нуклеиновых кислот

93.

Методы исследования ДНК и РНК
Электрофорез
1
2
3
+
-
4
Электролит
+
-

94.

Методы исследования ДНК и РНК
Гель-электрофорез
+
-
+
-

95.

Методы исследования ДНК и РНК
Гель-электрофорез
lgμ = lgμ0 - Kr·τ
μ – электрофоретическая подвижность в геле
μ0 – электрофоретическая подвижность в электролите
Kr – коэффициент замедления
τ – концентрация геля
z
μ = 6πηr
z – заряд молекулы
η – вязкость среды
r – радиус молекулы
Kr – коэффициент замедления
z – заряд молекулы
r – радиус молекулы

96.

Методы исследования ДНК и РНК
Гель-электрофорез

97.

Методы исследования ДНК и РНК
Гель-электрофорез
Зависимость электрофоретической подвижности от длины ДНК в гелях разной плотности

98.

Методы исследования ДНК и РНК
Гель-электрофорез
Определение длины фрагмента ДНК

99.

Методы исследования ДНК и РНК
Гель-электрофорез
Определение состояния ДНК
Линейная ДНК
Кольцевая ДНК
Кольцевая ДНК
Линейная ДНК
Кольцевая
суперскрученная ДНК
Кольцевая суперскрученная ДНК

100.

Методы исследования ДНК и РНК
Гель-электрофорез
Определение однонитевых разрывов в ДНК

101.

Методы исследования ДНК и РНК
Атомно-силовая микроскомия (АСМ)
Аtomic force microscopy (AFM)
Лазер
Фотодиод
Кантилевер
Основание
Зонд
Зонд на прямоугольной
консоли
(электронная микроскопия)
Образец
Подвижный столик

102.

Методы исследования ДНК и РНК
АСМ
Контактный режим

103.

Методы исследования ДНК и РНК
АСМ
«Полуконтактный» режим
Tapping mode

104.

Методы исследования ДНК и РНК
АСМ
Глобулярная структура хромосомы
Глобулы диаметром 80 нм

105.

Методы исследования ДНК и РНК
АСМ
Взаимодействие ДНК с белками
(для эффективного связывания требуется суперскрученность)
Линейная ДНК
Суперскрученная ДНК

106.

107.

Ультрацентрифугирование
Седиментация
1 D2 · ( ρч – ρс ) · a
Vs =
·
18
ηс
Ff
D – диаметр частицы
ρч – плотность частицы
ρс – плотность среды
ηс – вязкость среды
VS – скорость движения без ускорения
а = ω2r
Седиментация – движение с постоянной скоростью
Fg
При одинаковых плотностях частицы большего диаметра
седиментируют намного быстрее частиц меньшего диаметра
(D2)
r
ω
a = ω2r
ω – угловая
скорость (рад/с)
r – радиус (м)
Скорость седиментации пропорциональна плотности частицы.
Мелкие частицы с большей плотностью могут седиментировать
быстрее, чем крупные частицы с меньшей плотностью.
Скорость седиментации пропорциональна ускорению.
Скорость седиментации обратно пропорциональна вязкости
среды.

108.

Ультрацентрифугирование
Коэффициент и константа седиментации
1 D2 · ( ρч – ρс )
·
s =
18
ηс
http://www.ras.ru
s – коэффициент седиментации
при известных ρс и ηс s зависит только
от параметров частицы – D и ρч
Теодор Сведберг
(Theodor H. E. ("The") Svedberg)
1884-1971
Если седиментация происходит в воде при 20°С (ρ20,W и η20,W известны),
то s в воде при 20°С – это константа седиментации s20,W
s20,W
1 D2 · ( ρч – ρ20,W )
=
·
18
η20,W
1 S (сведберг) = 10-13 сек

109.

Ультрацентрифугирование
Ультрацентрифуга
Молекулы с разными Vs
1923 г. – 5000 g
1926 г. – 100000 g
1931 г. – 200000 g
1933 г. – 400000 g
1934 г. – 900000 g
1–
2–
3–
4–
5–
6–
7–
8–
9–
10 –
11 –
12 –
Мотор
Ротор
Бронированная камера
Зеркало
Оптическая система
Путь света
Регистрирующее устройство
Элементы управления
Контроль температуры
Источник света
Вакуумный насос
Система охлаждения

110.

Ультрацентрифугирование
Плавучая плотность
( ρч – ρ20,W ) · ηс
V
s20,W = s ·
a
( ρч – ρс ) · η20,W
Создание градиента плотности
в колонке Линдерстрема-Ланга
Annu.Rev.Biochem.-2005.-74.-1–28
Кай Ульрик Линдерстрем-Ланг
(Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang)
1896-1959
h
ρ
h

111.

Ультрацентрифугирование
Плавучая плотность
( ρч – ρ20,W ) · ηс
V
s20,W = s ·
a
( ρч – ρс ) · η20,W
Формированиее градиента плотности
при ультрацентрифугировании растворов солей
Градиент
Время
t=0
t1
t2
t3
t4
Мениск
Дно

112.

Ультрацентрифугирование
Плавучая плотность
s20,W
h
( ρч – ρ20,W ) · ηс
Vs
= a ·
( ρч – ρс ) · η20,W
ρ
h
Плавучая плотность ρч
плотность частицы в растворе
плотность среды, при которой
движение частицы прекращается,
т.е. разность ρч – ρс = 0

113.

Ультрацентрифугирование
Плавучая плотность
s20,W
( ρч – ρ20,W ) · ηс
Vs
= a ·
( ρч – ρс ) · η20,W
ρч – ρс = 0
ρч – ρс = 0

114.

Ультрацентрифугирование
Седиментация
f
Mч = s ·
( 1 – ρс / ρч )
f – фактор трения
зависит от:
формы частицы
размера частицы
вязкости жидкости
Определение Мч с применением седиментационного анализа
требует определенных допущений
Видимая Мч зависит от формы и размера частицы
По результатам седиментационного анализа видимую Мч
выражают в сведбергах:
5S рРНК, 16S рРНК, 23S рРНК, 30S субъединица рибосомы, и т.д.

115.

Небольшое отступление
Разделение частиц по плавучей плотности
Градиент плотности CsCl
Незрелые
вирусные
частицы
Зрелые
вирусные
частицы
Methods in Biotechnology, Vol. 24: Animal Cell Biotechnology

116.

Ультрацентрифугирование
Разделение частиц по плавучей плотности
Градиент плотности CsCl
Для ДНК митохондрий
человека
Линейная и
кольцевая ДНК
Суперскрученная
ДНК
Journal of General Virology.-2000.-81.-3073-3082
s20,W = 26
s20,W = 37