Механизмы нейропротекторного действия уабаина при эксайтотоксическом стрессе в нейронах коры крыс

1. Механизмы нейропротекторного действия уабаина при эксайтотоксическом стрессе в нейронах коры крыс

Большаков А.Е.
03.03.01 – физиология
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН
Лаборатория сравнительной физиологии мозжечка
Научный руководитель: д.б.н. Антонов С. М.
Санкт-Петербург, 2015г.

2.

Введение
Глутамат - основной возбуждающий нейромедиатор
в нервной системе позвоночных (Meldrum, 2000).
Нейродегенеративные болезни поражают десятки
миллионов людей в мире и приносит ущерб в сотни
миллиардов долларов. (Fillit, Hill, 2005).
Глутаматэргическая теория нейродегенеративного
процесса: «Универсальный механизм развития всех
нейродегенеративных заболеваний эксайтотоксичность в результате избыточной
активации постсинаптических глутаматных
рецепторов NMDA-типа».
Эксайтотоксичность (от англ. exite – возбуждать) патологический токсический процесс,
развивающийся при гипервозбуждении рецепторов
глутамата.
Разработки и изучение эндогенной защиты мозга от
нейродегенеративного повреждения - возможность
направленной регуляции состояния клеток
модулирующими веществами.
Данная работа посвящена одному из претендентов
этой группы - уабаину.
2

3. и

Цель и задачи исследования
Изучение механизмов действия уабаина в широком диапазоне концентраций в
нормальных условиях и эксайтотоксическом стрессе, вызванном агонистами ионотропных
рецепторов глутамата в первичной культуре нейронов коры крыс.
1. Исследовать влияние уабаина в субнаномолярных концентрациях (от 0,01 нМ до 1 нМ) в
условиях цитотоксического действия NMDA и КА на нейроны коры крыс для оценки его
нейропротекторного потенциала;
2. Исследовать механизм собственного цитотоксического действия уабаина на нейроны коры
в широком диапазоне концентраций (от 0,1 нМ до 0,1 мМ);
3. Оценить возможное тоническое действие эндогенного глутамата в нормальных условиях на
электрогенез нейронов;
4.
Исследовать действие субнаномолярных концентраций уабаина на интегральные токи,
вызываемые NMDA и КА, и спонтанную синаптическую активность нейронной сети;
5.
Исследовать роль внутриклеточного Са2+ сигнала в запуске эксайтотоксичности и при
реализации эффектов субнаномолярных концентрации уабаина;
6.
Исследовать работу мембранного
рецепторов глутамата и уабаина.
Na+/Ca2+-обменника
при
воздействии
агониста
3

4.

Основные положения, выносимые на
защиту
1. Уабаин в субнаномолярных концентрациях способен защищать нейроны от апоптоза
благодаря регуляции внутриклеточной концентрации кальция с помощью увеличения
активности по его выведению из нейронов Na+/Ca2+–обменником, образующим
функциональную группу взаимодействия с Na+/K+-АТФазой.
2. Нейропротекторное действие уабаина не связано с блокадой каналов рецепторов
глутамата и замещением K+ в ионном транспорте Na+/K+-АТФазы, но задействует её
сигнальную функцию в субнаномаолярных концентрациях, используя фермент в качестве
«рецептора» и стабилизируя значения частоты сВПСТ при насыщающих концентрациях
агонистов рецепторов глутамата.
4

5. Витальный экспресс-тест

Конфокальный микроскоп
Прижизненная съёмка.
Окраска АО и ЭБ.
5

6. Контроль

Количество клеток, %
Контроль
6

7. Эксайтотоксичность

30 µM NMDA
30 µM KA
7

8. Эффект 1 нМ уабаина при нейротоксическом действии NMDA

Контроль
30 мкМ NMDA
30 мкМ NMDA + 1 нМ Oub
8

9. Эффект 1 нM уабаина при нейротоксическом действии KA

Контроль
30 мкM KA
30 мкM KA + 1 нM Oub
9

10. Процентные соотношения апоптотических (А), некротических (N) и живых (L) клеток

10

11. Выявление пороговой концентрации антиапоптотического действия уабаина

NMDA
*
KA
*
*
*
11

12. Воздействие уабаина на интактную культуру нейронов

12

13. Действие уабаина на экспрессию Bcl-2 при эксайтотоксическом воздействии агонистов рецепторов глутамата

13

14. Неквантовое высвобождение глутамата в культуре нейронов коры головного мозга

Установка для пэтч-кламп
Пэтч-кламп нейрона
в конфигурации «целая клетка».
На фото культура нейронов и стеклянный
микроэлектрод.
Протокол RAMP
Интактная культура нейронов. Скопления нейронов и
мощные тяжи отростков между ганглиями. Съёмка
14
изображения с применением фазового контраста.

15. Эффекты NMDA и КА на интегральные токи и сВПСТ

7
Частота мВПСТ, Гц
6
5
4
3
2
1
0
15
Контроль 30 µM NMDA
Контроль 30 µM KA

16. Кальциевый имиджинг

t
16

17. Влияние агонистов рецепторов глутамата и уабаина на концентрацию внутриклеточного свободного кальция

17

18.

Связывание внутриклеточного Са2+
нивелирует эффект повышения
частоты сВПСТ
18

19.

Влияние 1 нМ уабаина на сВПСТ при
действии NMDA и КА
19

20. Исследование вольт-амперной характеристики каналов NMDAR и AMPA/KAR

20

21. Влияние блокады Na+/Ca2+- обменника на эффект уабаина в отношении сВПСТ и [Ca2+]i

Влияние блокады Na+/Ca2+обменника на эффект уабаина в
отношении сВПСТ и [Ca2+]i
21

22. Заключение

22

23. Выводы

4. Действие NMDA и КА сопровождается генерацией входящих деполяризующих
токов и значительным повышением частоты сВПСТ. Увеличение частоты
1. Уабаин в условиях эксайтотоксического стресса оказывает нейропротекторное
спонтанных синаптических токов полностью нивелируется уабаином в
воздействие, повышая выживаемсть кортикальных нейронов путём купирования
концентрации 1 нМ и определяется увеличением концентрацией свободного
развития апоптоза в результате стабилизации клеточного метаболизма, 2+
кальция в пресинаптических терминалях. Загрузка нейронов хелатором Са
отражением чего является повышение экспрессии антиапоптотического белка BclВАРТА, аналогично 1 нМ уабаина, вызывает уменьшение частоты сВПСТ при
2. Нейропротекторное действие уабаина сохраняется в интервале двух порядков
действии NMDA.
субнаномолярых концентраций от 0,01 нМ до 1 нМ.
5. При длительной аппликации насыщяющих концентраций NMDA уровень [Са2+]i
вырастает и характеризуется двумя волнами внутриклеточной кальциевой
первичной
– в связи с открытием
каналов рецепторов
и вторичной – в
2. дерегуляции,
В субнаномолярных
концентрациях
уабаин не оказывает
на кортикальные
связи
с нарушением
целостности
митоходриальных
депо.
Уабаин в наномолярных
нейроны
токсического
влияния - соотношение
живых,
некротических
и
2+
концентрациях
ослабляетинтактной
рост [Са ]культуре.
её к контрольным
апоптотическихсущественно
клеток соответствует
Собственный
i , приводя
значениям.
цитотокчический эффект уабаина развивается, начиная с концентрации 10 нМ,
определяется, очевидно, ингибированием ферментативной активности Na+/K+6. Нейропротекторный эффект наномолярных концентраций уабаина при
АТФазы и развивается по пути некроза. Нейропротенторное действие уабаина не
эксайтотоксическом стрессе реализуется по двум направлениям, которые
связано с транспортной функцией этого фермента.
характеризуются различной скоростью ответов. Первое – стабилизация Ca2+
клиренса через образование функиональных групп Na+/К+–АТФаза/NCX и быструю
откачку Ca2+ после первичной кальциевой дерегуляции, вызванной агонистами
3. В культуре нейронов коры головного мозга в покое происходит неквантовое
глутаматных рецепторов. Этот ответ проявляется сразу и является быстрым.
тоническое высвобождение глутамата, который в условиях нарушения
Второе – инициация внутриклеточных антиапоптотических сигнальных каскадов,
функционирования глутаматных транспортеров может обеспечивать выброс
которая выражается в экспрессии белка Bcl-2 и восстановлении нормальных
нейромедиатора, достаточный для запуска нейродегенеративных процессов.
клеточных функций, с затратой большего времени (десятки минут – часы), что
23
характеризует этот ответ как медленный.
Выводы

24. Коллеги

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ
25