Приготовление гистологических срезов. Микротомы и микротомные ножи. Техника резки на микротомах. (Лекция 16)

1.

Приготовление гистологических срезов.
Микротомы и микротомные ножи.
Техника резки на микротомах, ошибки
и их устранение
Заведующая ПАО ГБУЗ СО «Городская больница № 5,
г.Каменск-Уральский» к.м.н Баранова Е.Ю.

2. Микротомия – это получение тонких срезов из парафинового блока, в котором заключен образец ткани. Криотомия – это получение тонких срезов

3.

►Для получения гистологических срезов используются
специальные приборы – микротомы. Микротомы позволяют
получить гистологические срезы различной толщины (от 3 до 5-7
микрон)
►По принципу действия различают санные, ротационные,
замораживающие (криотомы), вибротомы
В рутинной гистологической практике используются санные и
ротационные микротомы
Ротационный микротом Sakura SRM200
Традиционно лаборанты-гистологи
работают на санных микротомах МС-2

4.

Приготовление парафиновых срезов
►Парафиновый блок зажимают в объектодержатель
►Установив нужный угол наклона ножа (оптимальный 13-15 градусов) в
зависимости от характера ткани, медленно подводят микротомный нож к
блоку и приступают в резанию материала

5.

Срезы с поверхности ножа осторожно снимаются мягкой кисточкой и
расправляют

6.

Подготовка предметных стекол
Для того, чтобы срезы прочно пристали к предметному стеклу и не отклеились
во время окраски, стекла обрабатывают специальным способом с целью
обезжиривания
►Предметные стекла моют в теплой мыльной воде или кипятят в 2-3 %
растворе натрия гидрокарбоната (питьевой соды), затем промывают в в течение
нескольких часов в проточной воде
►Обработанные таким образом стекла протирают чистой хлопчатобумажной
тканью и на несколько дней помещают в смесь Никифорова (96% этанол+ эфир,
пропорция 1:1)
►Обезжиренные стекла извлекают пинцетом из смеси Никифорова, протирают
чистой тканью и складывают в коробки
Для обезжиривания стекол можно использовать хромовую смесь (100 гр
бихромата калия, концентрированная серная кислота и 1 литр горячей воды).
Стекла выдерживают в ромовой смеси 2-3 дня, затем тщательно промывают в
проточной воде в течение 1-2 дней
►Качество обезжиривания можно проверить, капнув на предметное стекло воду
из пипетки: по обезжиренному стеклу вода растекается тонким слоем, а не
собирается в каплю
☻В настоящее время используются специальным образом шлифованные
предметные стекла с матовой полосой для надписей, не требующие
обезжиривания - стекла с адгезивным покрытием!

7.

Приготовление белка для наклеивания срезов
►Для лучшей фиксации срезов на стекле, предметное стекло предварительно
смазывают смесью яичного белка с глицерином.
►Свежий яичный белок взвивается столовой вилкой или шпателем до состояния
пены
►Фильтруется в течение 24 часов через широкопористый фильтр
►К профильтрованному белку добавляется равный объем глицерина,
перемешивается
►В смесь добавляется небольшой кусочек камфары или тимола для консервации
►На сухое обезжиренное предметное стекло капают маленькую каплю белковоглицериновой смеси
►Сухим чистым обработанным спиртом пальцем тщательно растирают смесь
по стеклу
►Стекло проводят 2-3 раза над пламенем спиртовки (как при фиксации
бактерий), намазанной стороной вверх
►Можно наклеивать парафиновые срезы

8.

Парафиновые срезы наклеиваются на предметное стекло непосредственно с
ножа
►Срезы переносят в ванночку с
теплой (35-40 С) водой, затем вылавливают и помещают на подготовленное предметное стекло с помощью изогнутой препаровальной
иглы
►Стекло со срезом подсушивают в
термостате либо на специальных
подсушивающих гистологических
столиках

9.

Правила резания на микротомах, микротомные ножи, угол наклона и угол
резания
►Микротомный нож – сложный стальной клин, у которого режущий край
имеет еще дополнительную клинкообразную заточку. Длина ножа от 8 до 25
см
Различают - по длине ножа
1. Малые ножи- 8-13 см, используются для замораживающих микротомов
2. Средние ножи – 17-20 см, используются для рутинной резки парафиновых
блоков
3. Большие ножи – 25 см и более –используют для получения
гистотопографических срезов в научно-исследовательских целях
По форме клина ножа
1. Прямые – обе стороны ножа плоские – для парафиновых блоков (наиболее
удобны и широко распространены)
2. Плосковогнутые - одна сторона плоская, другая вогнутая
3. Двояковогнутые – ограничены в применении, подходят только для
специальных микротомов
По углу сечения лезвия ножа (по шлифу)
1. Очень тонкие (ножи группы А) – острый угол заточки и тонкий шлиф –
для нежных мягких тканей
2. Плосковогнутые ножи группы В - для мягких тканей и рутинной работы
3. Ножи группы С – для парафиновых блоков, плотных тканей

10.

Для работы на санном микротоме используют
МНОГОРАЗОВЫЕ микротомные ножи, которые
периодически необходимо затачивать
В настоящее время многоразовые микротомные
ножи затачивают с помощью специальных
аппаратов
Однако, не потеряла актуальность ручная точка и
правка микротомных ножей
Используют точильный камень, имеющий форму
бруска (желтый – «бельгийский» камень и белый
«арканзас»)
►Первым используют «бельгийский» желтый камень, перед заточкой на
камень наносится машинное масло или керосин, глицерин, разведенный 70%
спиртом. Нож проводят по камню с одного конца на другой, затем поворачивая
через обушок, осуществляют движение в обратном направлении. Продолжают
заточку на белом камне, имеющем более мелкозернистую поверхность
►Продолжительность заточки зависит от квалификации лаборанта и
составляет в среднем от 30 минут до 1 часа, затем проводят правку ножа на
ремне, натянутом на деревянную колодку

11.

Качество заточки ножа контролируется следующим образом:
Осторожно укладывается нож на предметный столик микроскопа и
перемещая его так, чтобы режущая кромка проходила через поле зрения
объектива микроскопа на малом увеличении . Режущая кромка не должна
иметь зазубрин и серповидной выработки и прочих дефектов режущего
края
Наклон микротомного ножа и угол резания
При резке кусочков микротомный нож всегда закрепляется в зажиме
микротома наклонно, под некоторым углом к горизонтальной плоскости.
Нож хорошо режет при правильном наклоне. При слишком горизонтальной
установке наклона ножа (тупой угол) – нож будет скользить, не захватывая
срезов, при крутом наклоне (острый угол) – нож будет грубо врезаться в
блок. Поэтому угол наклона ножа подбирается лаборантом опытным путем
(оптимальный угол наклона ножа 13-15 градусов).
Угол резания – острый угол, образуемый пересечением верхней плоскости
объекта (парафинового блока) с нижней плоскостью ножа. Наилучший угол
резания составляет 15 градусов. Критерием правильной установки угла
резания служит получение ровных срезов
На качество резки и угол наклона влияют острота заточки ножа и качество
заливки парафинового блока

12.

Недостатки работы с МНОГОРАЗОВЫМИ ножами
1.
Невозможно получить качественные срезы мягких тканей
2.
Трудности в получении тонких (до 1 мм толщиной) срезов
3.
Проблематичность организации процесса заточки ножа
4.
Дороговизна абразивных материалов, необходимых для заточки
5.
Необходимость закупки дополнительного оборудования для заточки ножей
В настоящее время для работы используются ОДНОРАЗОВЫЕ лезвия

13.

Современный санный микротом sakura пр-во Япония
Микротом ротационный Accu-Cut

14.

Угол резания

15.

МИКРОТОМ ГОТОВ К РАБОТЕ

16.

Причины ошибок, встречающихся при резании материала и их устранение
►парафин крошится
Причина – тугоплавкий парафин, медленно охлаждался при заливке, низкая
температура окружающей среды, большой угол наклона ножа
☻Устранение- перед получением среза подышать на блок, изменить угол
наклона ножа, перезолить объект
►Залитый материал в процессе резки выпадает из блока
Причина – заливка проводилась холодным парафином, плохая пропитка
материала, при проводке остались следы спирта
☻Устранение- перезолить блок, предварительно поместив его в
промежуточную среду для удаления спирта
►материал плохо режется или совсем не режется, ткань белесоватого цвета,
срезы сморщенные, плохо расправляются
Причина – недостаточное обезвоживание ткани
☻Устранение- блок расплавляют в термостате и пропускают по батарее в
обратном порядке до 100% спирта, затем снова заливают по схеме
►Нож как бы подскакивает, проскальзывая над поверхностью блока, не
срезает ткань или на срезах образуются поперечные полосы
Причина – переуплотнение или пересушивание материала при фиксации и
обезвоживании
☻Устранение- резать материал, поместив на него кусочек льда, если срезы не
получаются, материал испорчен! Из архива вырезают новый кусочек ткани и
проводят по батарее

17.

Причины ошибок, встречающихся при резании материала и их устранение
►Срезы сморщенные, закручиваются, прилипают к поверхности ножа, мнутся
Причина – недостаточный угол наклона ножа, высокая температура в
помещении, материал залит в легкоплавкий парафин
☻Устранение- изменить угол наклона ножа, перед резкой поместить блок в
холодильник, перезолить в более твердый парафин
►Срезы покрыты полосами и легко рвутся
Причина – плохое качество ножа (зазубрины), грязный парафин (плотные
соринки), наличие в кусочке кальцинатов (каменистых включений солей
кальция), встречающихся в соединительной, хрящевой костной тканях
☻Устранение- передвинуть нож ли сменить его на хорошо заточенный,
декальцинировать объект или воспользоваться микротомным ножом для резки
плотных тканей
►Срез прилипает к ножу (элетризация)
Причина – статическое электричество
☻Устранение- перед получением среза подышать на блок

18.

Рабочее место лаборанта-гистолога BioOptica – современные «умные» приборы для
работы лаборанта - гистолога
Все необходимые рабочие модули для этапа
микротомии:
- охлаждающая панель
- нагревательная панель
- ванночка для расправления срезов
- встроенная терморегулируемая водяная
баня
- удобное освещение рабочего
пространства