Лабораторная диагностика бруцеллёза

1.

Լաբորատոր
ախտորոշում
Доц. Новицкая Ирина Вячеславовна
2021 г.

2.

Բրուցելոզի լաբորատոր ախտորոշման
սխեմա

3.

Բրուցելոզի լաբորատոր ախտորոշման սխեմա

4.

Բրուցելոզի լաբորատոր ախտորոշումը
ներառում է՝
- проведение диагностических исследований клинического материала от
людей для установления диагноза у больных с подозрением на заболевание
бруцеллезом. Клинический материал: արյուն, շիճուկ крови, спинномозговая
жидкость, синовиальная жидкость (при артритах), մեզ, լեղի, թարախ (при
абсцессах), пунктаты костного мозга и лимфатических узлов;
- проведение по эпидпоказаниям лабораторных исследований материала
из сырья животного происхождения (шерсть, кожа), продовольственного
сырья (միս и мясные продукты, կաթ и молочные продукты) и из объектов
окружающей среды (почва, трава, фураж, подстилка, вода, смывы и т.д.)
Забор материала и лабораторное հետազոտություն материала от больных
животных производят ветеринарные службы

5.

При работе с материалом, зараженным или
подозрительным на зараженность возбудителем
бруцеллеза, соблюдают:
СП 3.1.085-96 Санитарные правила «Профилактика и борьба
с заразными болезнями, общими для человека и животных»
ВП 13.3.1302-96 Ветеринарные правила
СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I II групп патогенности (опасности)» Санитарноэпидемиологические правила
МУ 3.1.7.1189-03 «Профилактика и лабораторная диагностика
бруцеллеза людей» (М.,2003)
МУК 4.2.3010-12 «Порядок организации и проведения лабораторной
диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального,
регионального и федерального уровней» (М., 2012)

6.

Требования к лабораториям медицинских организаций,
осуществляющим исследования на бруцеллез:
Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов
Требования к обеспечению безопасности работы персонала - инструкций,
определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ.
Все сотрудники обязаны выполнять требования по обеспечению безопасности
работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями
инфекционных болезней III-IV групп патогенности (опасности), в соответствии с
действующими нормативными документами
Требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении
исследований на бруцеллез - Исследования на бруцеллез могут выполнять
специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим
образованием, окончившие соответствующие курсы профессиональной
переподготовки с освоением методов безопасной работы с возбудителями
инфекционных болезней I-IV групп патогенности (опасности), не имеющие
противопоказаний к лечению специфическими препаратами и имеющие допуск к
работе с ПБА III-IV групп на основании приказа руководителя учреждения
Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием
возбудителей инфекционных болезней, должны повышать квалификацию не реже
одного раза в пять лет и иметь сертификат специалиста

7.

Возбудителей бруцеллеза относят ко
II группе патогенности:
Вид
B. melitensis
Биовары
3
Эпидемиологическая значимость
Возбудители эпидемического
бруцеллеза
–
B. abortus
8
B. suis
5
B. neotomae
-
B. ovis
-
B. canis
-
В. maris
-
Возбудители спорадического
бруцеллеза

8.

Բրուցելոզի լաբորատոր ախտորոշման
մեթոդները՝
Մանրադիտակային
Մանրէաբանական
Կենսաբանական
Իմունաբանական
Ալերգոլոգիական
Մոլեկուլային-գենետիկական

9.

Մանրադիտակային մեթոդ
Материал для микроскопияеского иссследования: органы
абортированного плода, плацента и выделениях из родовых путей
больных животных, биологический материал от людей, а также
выделенные կուլտուրաներ на этапах их идентификации
Окрашивание по Граму или по Козловскому - по Граму окрашиваются
отрицательно, при окраске по методу Козловского бруцеллы
приобретают розово-красный цвет сафранина (в то время как другие
микроорганизмы – зеленые)
«Раздавленная капля» – неподвижны
Спорообразование - отсутствует
В мазке: полиморфизм, кокковидная или палочковидная формы
клеток с закругленными концами размером 0,5-2 мкм в длину и 0,3-0,7
мкм в ширину. В одном препарате, особенно в молодых կուլտուրաх,
возможно беспорядочное присутствие всех морфологических форм
Бруцеллы вида B.melitensis чаще представлены кокковидными формами, а
микроорганизмы B.abortus и B.suis – палочками с закругленными концами
Клетки B.suis несколько крупнее остальных видов бруцелл

10.

Մանրէաբանական մեթոդ- «золотой
стандарт микробиологии»
Бактериологическое подтверждение инфицирования
организма возбудителем бруцеллеза обеспечивается
не всегда. Эффективность бактериологической
диагностики бруцеллезной инфекции во многом
зависит от качества используемых для выделения
возбудителя питательных сред и используемых
селективных добавок

11.

Материал для бактериологического
исследования:
от людей - արյուն, ոսկրածուծ, спинномозговая жидкость,
пунктат из лимфоузлов, մեզ, суставная жидкость, ликвор,
թարախное отделяемое, мокрота и другой клинический
материал - осуществляют при поступлении до начала
антибиотикотерапии;
от животных - абортированные плоды, плодные
оболочки, желудок плода с его содержимым, ավշային
հանգույցներ, влагалищные выделения, կաթ;
пищевые продукты - сливки, сыры, творог, միս;
объекты внешней среды - вода, почва, навоз, подстилки
животных, кормушки и т.д.

12.

Մանրէաբանական հետազոտություն посевов от
биопробных животных:
Перед посевом органов на սննդարար միջավայրեր их
целесообразно раздавить (Таран И.Ф., Лямкин Г.Н., 1996)
Для этого кусочки органов берут в стерильную чашку или
керамическую ступку, которые заворачивают в салфетку,
смоченную дезраствором. В таком виде материал переносят
из вскрывочной комнаты в лабораторный бокс, где
раздавленную стерильной деревянной палочкой или
пестиком ткань органа втирают в плотные սննդարար
միջավայրեր
Культуры выдерживают при 37 0С в течение 25-30 сут
Просмотр посевов производят каждые 3-4 сут
Выделенные микроорганизмы подвергают видовой
идентификации и дифференциации

13.

Питательные среды для выделения и культивирования бруцелл:
Мясо-пептонный, печеночный, глюкозо-глицериновый, сывороточнодекстрозный бульоны и агары
Агары Мартена и Альбими
Среды «Д», «4Д»
Среда Мюллер-Хинтона
Эритрит-агар с добавлением 1% глюкозы и 2% глицерина (г. Махачкала)
Среда особенно эффективна при выделении первой генерации возбудителя, однако при
последующих пересевах на эритрит-агаре կուլտուրա бруцелл нередко диссоциирует
Бруцеллагар, разработанный Государственным Научным Центром прикладной
микробиологии (г. Оболенск Московской обл.), как и
FT(«туляремийный»)-агар, которые при добавлении глюкозы (до 1%) и глицерина
(до конечной концентрации 2%) также на 3 сут обеспечивают աճ колоний возбудителя
бруцеллеза
Среда для культивирования B. ovis (печеночный или միսпептонный агар c
добавлением 1% D-глюкозы и 2% глицерина, 20% нормальной сыворотки КРС или
10% аминопептида и 10% сыворотки
Среда для выделения и культивирования L-форм бруцелл и др.

14.

Рекомендуемые добавки:
Декстроза (D-глюкоза) (до 1%)
Глицерин (до 2%)
Дефибринированная արյուն барана или
лошади (до 5%)
Липоевая кислота (5 мг/л)
Витамин К
Витамин В1 (тиамина гидрохлорид)

15.

Другие коммерческие сухие среды:
В настоящее время ряд зарубежных фирм (в частности, «Hi Media Laboratories Pvt.Ltd»,
Индия) для лабораторной диагностики бруцеллеза производят коммерческие сухие
сертифицированные в соответствии с Европейским стандартом качества (СЕ) питательные
основы сред и селективные добавки
Brucella Selective Medium Base (w/o Supplement) + Selective
Supplement
Eugonic Agar/Broth
Tryptose Soya Agar
Brucella Selective Medium Base агар
рекомендуют для селективного
выделения и культивирования
бруцелл
Баранья արյուն и настой
говяжьего сердца облегчают
культивирование различных
прихотливых микроорганизмов
Триптоза, желатин, глюкоза источники необходимых
питательных веществ
Присутствие антибиотиков
делает среду высоко селективной
в отношение бруцелл
Ингредиенты
грамм/литр
Настой говяжьего сердца
500,00
Триптоза
10,00
Натрия хлорид
5,00
Желатин
1,00
Глюкоза
2,50
Агар-агар
15,00
Конечное значение рН (при 25°С) 7,4 ±
0,2
Инструкция по применению: Размешать 21,75 г
порошка в 500 мл дистиллированной воды и
прокипятить. Стерилизовать автоклавированием
при 1,1 атм (121°С) 15 мин
Остудить до 50 °С и асептически добавить
растворенное в 50 %-м метаноле содержимое 1
флакона со специальной добавкой (FD161). Тщательно
перемешать и разлить в посуду

16.

Этапы бактериологичекого исследования при
подозрении на бруцеллез (Ляпустина Л.В.,1998):
Перевод исследуемого материала в жидкую фазу:
эмульгация в 0,85% растворе NaCl или бульоне
Концентрирование возбудителя в исследуемом
материале (центрифугирование пробы при 3000 g в
течение 2 ч, фильтрация и добавление к осадку
специфической бруцеллезной агглютинирующей
сыворотки в соотношении 1:100
Посев на соответствующие սննդարար միջավայրեր

17.

Транспортные среды для взятия материала в полевых
условиях:
Использование транспортных сред позволило повысить эффективность
бактериологической диагностики бруцеллеза до 70% (Богданов И.К., 1999, Ляпустина
Л.В.,2005)
В состав транспортной среды входят: питательная основа (гидролизат говяжьего мяса),
хлорид натрия, цитрат натрия, глицерин, глюкоза, липоевая кислота
Для транспортных целей возможно применение печеночного бульона с добавлением 1%
пептона, а также
0,85% раствора NaCl, разлитого в пенициллиновые флаконы, куда стерильно через
резиновую пробку шприцем вносят по 1 мл посевного материала (крови, спинномозговой
жидкости, синовиального экссудата, биоптата из очагов)
Упаковка проб: принцип тройной упаковки (водонепроницаемый герметичный
контейнер, адсорбирующий материал, вторичная упаковка и наружная упаковка не менее
10х10 см, опечатанная, маркированная, с надписью «верх, осторожно»). Транспорт –
специально выделенный
Недопустимо помещение сопроводительных документов в тару с пробами
В условиях специализированной лаборатории из транспортной среды делают высев на
соответствующие питательные агары

18.

Посев материала, загрязненного
посторонней микрофлорой:
Посев проб из объектов внешней среды или трупного материала
от животных осуществляют на սննդարար միջավայրեր с
ингибиторами աճа микробов-контаминантов:
генцианвиолет 1:200.000 или
антибиотики (пенициллин 25 мкг/мл, полимиксин 3 мкг/мл,
амфоглюкамин 3 мкг/мл, кефзол 3 мкг/мл, амфотерицин 1 мкг/мл),
не препятствующие աճу бруцелл

19.

Посев молока:
Исследование молока из больших емкостей проводят путем
забора 100 мл пробы из верхнего слоя и последующего взятия
после перемешивания еще 100 мл
Результативным бывает посев сливок, полученных
центрифугированием молока при 2000g в течение 3-5 мин или
после его отстаивания при 40 0С в течение 1 сут
Консервацию молока при проведении отсроченного анализа
осуществляют добавлением в него сухой борной кислоты (на
10 мл пробы 0,1 г борной кислоты), генцианвиолета до
конечной концентрации 1 : 250 000 или малахитгрюна 1 : 500 000

20.

Посев крови:
Посев крови от больного наиболее целесообразно
осуществлять во время лихорадочного периода, хотя դրական
արդյունք возможен и вне его
Кровь (по 5 мл) засевают в 2 флакона с бифазной средой или в
жидкие սննդարար միջավայրեր для транспортировки
При исследовании крови в жидкие սննդարար միջավայրեր перед
посевом рекомендуют добавлять стерильный раствор цитрата
натрия до конечной концентрации 0,2%
Кровь берут у постели больного и тут же засевают на սննդարար
միջավայրեր. Рекомендуется осуществлять эти процедуры вдвоем.
Один медицинский работник проводит обработку кожи больного и
венопункцию, второй в это время открывает над пламенем спиртовки
пробки флаконов со средами, подставляет их под струю крови из
шприца, обжигает и закрывает горлышки флаконов
Посевы крови инкубируют при 370С не менее 30 сут
во флаконах в вертикальном положении

21.

Посев крови на плотные среды (или высев из
бульонной կուլտուրաներ)
Также осуществляют во флаконы с широким горлом на
скошенный агар
Инкубация 370С – 30 сут в обычных условиях и
условиях 10% СО2
1 раз в 2-3 дня посевы осторожно перемешивают,
смачивая поверхность питательной среды
При появлении типичных колоний проводят их
идентификацию

22.

Культивирование бруцелл:
Бруцеллы требовательны к условиям
культивирования и обладают замедленным աճом
(от 3 до 14 сут и более)
Наиболее медленно растут կուլտուրաներ бруцелл,
выделенные из организма в первых генерациях
Лабораторные շտամներ
появляются на агаре через 24-48 ч
после посева
Оптимум температуры 370С
рН 7,2

23.

Потребность в СО2:
С учетом потребностей B. abortus и B. suis в
повышенном (5-10%) содержании СО2 в атмосфере
посевы дублируют в СО2-инкубаторах (или
эксикаторе) и в обычных условиях

24.

Автоматизированные системы учета
посевов крови:
В зарубежной практике հետազոտություն крови на гемокультуру является одним из
наиболее массовых видов лабораторных исследований
Применение автоматизированных систем для индикации микробного աճа в посевах
крови позволяет ускорить получение результата
Приборы для этой цели выпускаются многими фирмами. Они отличаются друг от
друга производительностью, уровнем автоматизации, но главное - способами
детекции микробного աճа
Одним из наиболее популярных в Европе анализаторов для детекции культур крови
является прибор VITAL, предлагаемый фирмой bioMerieux. Этот прибор позволяет
одновременно исследовать до 1200 образцов
Пробу крови объемом 5-10 мл засевают во флакон со специальной питательной
средой. Флакон устанавливают в блок детекции прибора и инкубируют при
осторожном встряхивании
Каждые 15 минут с помощью специальной флюоресцентной технологии прибор
осуществляет детекцию микробного աճа по продукции СО2, изменению рН и
модификации окислительно-восстановительного потенциала среды
Информация о получении положительного сигнала отражается звуковым сигналом,
выводится на монитор компъютера и дублируется внутри модуля детекции, рядом с
нужным флаконом. Время детекции от 9 до 120 часов

25.

Широкое распաճранение за рубежом получила
система для обнаружения микроорганизмов в крови фирмы Oxoid –
«Signal blood system»
Система состоит из двух сосудов, соединенных между собой с
помощью полой иглы. Нижний сосуд заполнен специальной
питательной средой и укупорен резиновой пробкой
После посева в пробку вставляют полую иглу, канюля которой
вмонтирована в дно верхнего сосуда, исполняющего роль
индикатора
При աճе микроорганизмов образуются газообразные продукты
метаболизма. В нижнем флаконе повышается давление, и часть
питательной среды с արյունю через иглу выдавливается в верхний
индикаторный сосуд. Открыв крышку индикаторного сосуда,
можно интактно взять материал для посева или приготовления
мазка
Такой подход позволяет регистрировать наличие бактериального
աճа на ранних этапах и резко упрощает процедуру ревизии посевов
При посевных дозах 1-13 клеток աճ бактерий разных видов
проявляется через 17-72 часа

26.

Для получения капсульных форм бруцелл
используют:
Среды с иммунной сывороткой
Яичные среды Петрова, Дорсе, Петраньяни
Культивирование в курином эмбрионе или
в присутствии специфического бактериофага

27.

L-формы бруцелл появляются после
антибиотикотерапии:
Способ посева бактериологического материала для выделения L-культур
идентичен с методом выделения бактериальных гемокультур
Посевы выдерживаются в термостате не менее 35 - 40 дней
Среда для выделения и культивирования L-культур бруцелл:
Основа –печеночный бульон, мясная вода, пептон, рН 7,8, с добавлением глицерина и
глюкозы
Заготовленный агар по мере надобности (перед посевом крови) расплавляют в
водяной бане, охлаждают до 50 °C и к нему добавляют 25% нормальной лошадиной
сыворотки (предварительно пաճерилизованной через фильтр Зейтца), 25%
печеночного или միսпептонного бульона (в соответствии с основой агара),
содержащего 50 - 100 ед. пенициллина на 1 мл среды
Посев крови, в объеме не менее 5 мл, пунктатов костного мозга и лимфоузлов
производят на питательную среду сразу же после застывания агара и добавления
бульона (метод предложен НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи)

28.

ՏարբերակումS- и R-форм бруцелл по White
& Wilson:
Исследуемые գաղութներ засевают на Альбими-агар,
разлитый в чашки Петри и подсушенный в течение 24 час
Посевы выдерживают при 370С в течение 96 час
На поверхность культур наслаивают водный раствор
кристаллвиолета 1:2000 на 15 сек
Краску сливают в дезраствор, գաղութներ
микроскопируют или просматривают
в проходящем свете
Шероховатые գաղութներ приобретают красную или
сине-красную окраску, S-формы остаются бледносиневатыми или бледно-фиолетовыми
Некоторые виды (B. ovis, B. canis) существуют преимущественно в
R-форме

29.

Родовую идентификацию выделенных культур
проводят на основании:
Изучения морфологии колоний
Микроскопии мазков, окрашенных по Граму или
Козловскому
По результатам прямого иммунофлуоресцентного
метода и
Реакции агглютинации на стекле с поливалентной
и монорецепторными շիճուկми
Окраска по
Граму
РА
МФА
B. abortus
Г-
+
+
B. melitensis
Г-
+
+
B. suis
Г-
+
+

30.

ՀայտնաբերումR-форм бруцелл:
Փորձ с трипафлавином
На предметном стекле изучают взаимодействие исследуемой
կուլտուրաներ с раствором трипафлавина 1:500. У диссоциированных
культур быстро (в течение 1-2 мин) начинается ագլյուտինացիա с
образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь из S-форм бруцелл
остается гомогенной
Ռեակցիա термопреципитации
Взвесь двухсуточной агаровой կուլտուրաներ бруцелл в 0,85% растворе Na Cl в
концентрации 1•109 м.к./мл подогревают в пробирке на водяной бане при 900С в
течение 30 мин. Результаты учитывают предварительно через 30-60 мин и
окончательно через 24 ч выдерживания при комнатной температуре
В эти сроки при наличии диссоциации наступает ясно выраженная
ագլյուտինացիա клеток бруцелл, тогда как взвесь клеток бруцелл
в Sформе остается гомогенной

31.

Փորձ с трипафлавином (ռեակցիա
Алессандрини и Сабатучи):
Трипафлавин – солянокислая соль 3,6-диамино-10-
метилакридина
Диссоциированные կուլտուրաներ бруцелл вызывают
агглютинацию на стекле в капле 0,2% раствора
трипафлавина в 0,15М NaCl,
Клетки недиссоциированных շտամов дают гомогенную
взвесь
Диссоциированные կուլտուրաներ
не сразу дают գաղութներ R-формы,
хотя ռեակցիա термопреципитации и проба с
трипафлавином уже будут положительными

32.

Феномен термопреципитации Бюрне:
Ռեակցիա направлена на выявление
диссоциированных շտամов, которые при
прогревании их կուլտուրաльной взвеси при 85-90
0С в течение 30 мин дают спонтанную
агглютинацию
Считают, что в процессе
диссоциации
у бруцелл нарастает
количество белков с
гидрофобными
свойствами

33.

Единые Видовые идентификационные тесты
для выделенных культур (видовая
дифференциация бруцелл):
Определены Подкомитетом по таксономии бруцелл Международного
комитета номенклатуры бактерий и Объединенным комитетом
ФАО/ВОЗ по бруцеллезу и включают:
изучение условий культивирования выделенных культур
определение их чувствительности к анилиновым краскам
определение способности образовывать сероводород
определение уреазной активности
изучение окислительно-метаболических реакций
изучение чувствительности к бруцеллезным фагам Tb ,Bk, Wb, Fi
выявление агглютинабельности монорецепторными (анти-abortus
и анти-melitensis) շիճուկми, а также
изучение вирулентности для лабораторных животных и
ряда других признаков

34.

Отношение к атмосферному СО2:
В отличие от B. melitensis и B. suis, կուլտուրաներ
B. abortus и B. ovis в первых генерациях растут лишь
при повышенном до 5-10% содержании СО2 в
атмосфере термостата
Вид бруцелл
Потребность в СО2
B.melitensis
-
B.abortus
+
B.suis
-
B.ovis
+

35.

Редуцирующая активность в отношении
основного фуксина и тионина:
Возбудители бруцеллеза относительно устойчивы к бактериостатическому действию
красителей – основного фуксина и тионина
Различная устойчивость к анилиновым краскам лежит в основе видовой
дифференциации бруцелл:
Фуксин 1:50000 не влияет на աճ B. abortus, но ингибирует աճ B. suis
Тионин 1:50000 не влияет на B. suis, но может ингибировать B. abortus
B. melitensis хорошо растет в присутствии всех анилиновых красителей
К расплавленному питательному агару добавляют основной раствор красок
(0,1 г краски, 20 мл 960 спирта, 80 мл дистиллированной воды) до
концентрации 20 мкг/мл и разливают пипеткой по 20-25 мл в каждую чашку.
Среды пригодны в течение 10-14 дней. Обесцвеченные среды не используют
Посевы производят секторами из взвеси 2-суточной агаровой կուլտուրաներ
бруцелл в концентрации 2•109 м.к./мл
Иногда используют диски с красками, которые помещают в чашки Петри на
плотную питательную среду с исследуемой культурой
Учет результатов осуществляют через каждые 48 ч при 370С в течение 6сут.

36.

Редуцирующая активность бруцелл в
отношении красителей:
Основной фуксин
1:50 000
Тионин
1:50 000(25 000)
+
+
-
+
+
B. melitensis
B. abortus
B. suis
фуксин
тионин

37.

Сульфатредуцирующая активность бруцелл:
Способность к образованию сероводорода выявляют на средах, содержащих
серу в легко редуцируемом состоянии (цистин, цистеин, тиогликолевая
кислота, тиомочевина)
Взвесь 2-суточной изучаемой կուլտուրաներ в концентрации 2•109 м.к./мл
засевают петлей диаметром 2 мм на пробирку с агаром. Под пробку
помещают полоску фильтровальной бумаги, смоченную насыщенным
раствором уксуснокислого свинца так, чтобы ее свободный конец не касался
посева. Посевы инкубируют в термостате при 370С. Результаты учитывают
через каждые 48 ч в течение 6 сут.
Показателем интенсивности образования сероводорода является
почернение свободного края фильтровальной бумаги, которое измеряют в
мм. При каждом учете почерневшую полоску заменяют новой. Для
окончательной оценки способности культур к образованию H2S все три
показателя складывают
Возбудители B.melitensis, B.ovis, B.canis Н2S не образуют
Для культур вида B. suis (1 биовар) суммарный показатель
составляет примерно 12-20 мм, для B. abortus (1 биовар) – около 5-7
мм, у культур B. neotomae равен 5-8 мм

38.

Образование H2S:
Суммарный показатель
B.melitensis
-
B.abortus (1 биовар)
5-7 мм
B.suis (1 биовар)
15-20 мм
B.ovis
B.neotomae
B.canis
5-8 мм
-
Ռեակցիա ацетата свинца с сероводородом с
образованием черного осадка сульфида свинца:

39.

Уреазной активностью обладают все
эпидемиологически значимые виды бруцелл:
Виды B.melitensis, B.abortus и B.suis гидролизуют мочевину в
среде Кристенсена с образованием аммиака и углекислоты, в
результате чего происходит изменение цвета среды из желтого в
розовый или малиновый
Наиболее выражена уреазная активность у бруцелл вида B.suis,
B.melitensis, B.neotomae, B.ovis, наименее – у B.abortus
Наиболее быстро и интенсивно изменение цвета среды Кристенсена
происходит при высеве культур B. suis
Менее интенсивно цвет среды изменяется при посеве культур
B. melitensis, наиболее медленно и слабо – при աճе B. abortus
Проведение дифференцирующих тестов осуществляют
параллельно и с референтными շտամами бруцелл
B.melitensis 16M, B.abortus 544, B.suis 1330 (биовар 1)
Уреаза - гидролитический фермент из группы амидаз, обладающий
специфическим свойством катализировать гидролиз мочевины до
диоксида углерода и аммиака: CO(NH2)2 + H2O → CO2 + 2NH3

40.

Որոշում дезаминазной активности бруцелл:
основано на качественном определении
образующегося в результате
гипоксантина
аммиака,
дезаминирования аденина до
Взвесь 2-сут агаровой կուլտուրաներ исследуемого շտամа в 0,15 М NaCl рН 7,2
3•109 м.к./мл делят на 2 части
В опытную пробирку добавляют 1 мл 1% раствора аденина, в контрольную – 1 мл
дистиллированной воды – ինկուբացիա при 370С - 24 ч, после чего
В каждую пробу добавляют по 0,2 мл реактива Несслера
Учет результатов производят визуально:
Если исследуемая կուլտուրա не обладает дезаминазной активностью в отношении
аденина (отрицательная проба) – раствор обесцвечен
или слегка окрашен в
желтовато-зеленый цвет, как и в контроле
При наличии дезаминазной активности (положительная проба) наблюдается яркокрасное окрашивание
Культуры бруцелл видов B. abortus и B. melitensis не обладают
дезаминазной активностью, для B. suis она характерна

41.

Агглютинация монорецепторными А- и Мշիճուկми:
Монорецепторные (anti-abortus и anti-melitensis) сыворотки в объеме 0,5
мл титруют в 0,15 М растворе NaCl от 1:10 до их предельного титра
Во все опытные пробирки добавляют взвесь 2-суточной агаровой
կուլտուրաներ изучаемого շտամа в концентрации 2•109 м.к./мл в 0,15 М
растворе NaCl по 0,5 мл
Контролями служат эталонные շտամներ B.abortus 544 и B.melitensis 16М
Инкубация 370С- 2 ч, комн t 18-20 ч
Агглютинацию на 2+ и более с разведения 1: 20
учитывают как դրական արդյունք
Бруцеллы вида B.melitensis (1 биовар) образуют
хлопья
агглютината с монорецепторной
сывороткой
anti-В.melitensis,
կուլտուրաներ вида B.abortus (1 биовар) – сывороткой anti-В.abortus
Для культур бруцелл видов B.ovis и B.canis и других, находящихся в Rформе, при проведении реакции агглютинации используют R-сыворотку,
которую титруют в ФБР рН 8,2-8,4

42.

43.

Пробы с фагами:

44.

Чувствительность к бруцеллезным
диагностическим бактериофагам:
Для постановки теста используют набор бактериофагов
бруцеллезных диагностических Тb; Wb, BK2, Fi (производства
ФГУЗ СтавропольНИПЧИ Роспотребнадзора) в рабочем
диагностическом титре (РДТ)
Для посева применяют 1-2-суточную взвесь агаровой կուլտուրաներ
в концентрации 2•109 м.к./мл в 0,15 М растворе NaCl
Посев изучаемых культур осуществляют «газоном», на который
«дорожкой» или петлей наслаивают бактериофаги,
Пробу с бактериофагами можно проводить двуслойным методом
Необходимым условием успешной постановки пробы является
подсушивание посева կուլտուրաներ до нанесения бактериофагов
Результаты учитываются через 24-36 ч инкубации при 370С

45.

Փորձ с фагом (двуслойный метод):
0,7% полужидкий агар в пробирке растапливают над пламенем
спиртовки, пока столбик агара не начнет образовывать пузыри
и подниматься вверх
Пробирку остужают до 45 0С
В охлажденный до 45 0С агар добавляют бульонную культуру
исследуемого շտամа «средней мутности» (109 м.к./мл – 0,3-0,4
мл)
Выливают через край на чашку Петри с питательной средой и
оставляют в приоткрытом виде
После подсушивания (37 0С 30 мин)
в сооответствии с предварительно
произведенной разметкой наносят
краем петли раствор фага

46.

Փորձ с фагами методом дисков:
Фаголизабельность исследуемого շտամа бруцелл также
может быть выявлена с помощью дисков,
импрегнированных бактериофагами
Диски помещают в чашки Петри с плотной питательной
средой, засеянной газоном исследуемой կուլտուրաներ

47.

Чувствительность различных видов Brucella к
специфическим бактериофагам:
Тбилиси
ТВ
Weybridge
Wb
Firenze
Fi
Berkley
Bk2
B.abortus
+
+
+
+
B.melitensis
–
–
–
+
B.suis
–
+
±
+
B.neotomae
±
+
+
+
Примечание:
ТВ – фаг Тбилиси;
Wb – фаг Weybridge;
Fi – фаг Firenze;
Bk2 – фаг Berkley;
РДТ – рабочий диагностический титр;
«+» – полный лизис կուլտուրաներ
«±» – частичный лизис կուլտուրաներ
«-» – отсутствие лизиса

48.

Биохимическая նույնականացում бруцелл:
Процесс дифференциации бруцелл может быть дополнен
определением окислительно-метаболической активности в
отношении 12 субстратов (L-аланин, L-аспарагин, Lглутаминовая кислота, L-аргинин, L-цитрулин, DLорнитин, L-лизин, D-рибоза, D-ксилоза, D-галактоза, Dглюкоза, эритритол), а также выявлением адениндезаминазной активности возбудителя бруцеллеза
Бруцеллы разлагают углеводы до образования кислоты и
газа, кроме ферментации глюкозы и арабинозы

49.

Упрощенная схема видовой
дифференциации культур рода Brucella:
Условия
роста
Бактериостатическое
действие красок:
Фуксин
Тионин
1:50 тыс
1:25 тыс
Образова
ние H2S
ADAактивност
ь
B. melitensis
О2
+
+
-
-
B. аbortus
О2
-
+
+
-
B. suis
5-10%
СО2
+
-
+
+

50.

Կենսաբանական մեթոդը բրուցելոզի
լաբորատոր ախտորոշման մեջ
Կենսաբանական метод диагностики бруцеллеза применяется
параллельно с бактериологическим при исследовании
материала, контаминированного посторонней микробиотой
(органы трупа, выделения больного, пищевые продукты, вода,
почва и т.д.) или материала с заведомо невысокой
концентрацией бруцелл
Нередко чистую культуру возбудителя бруцеллеза возможно
выделить только через биопробу

51.

Биологическая проба при исследовании на бруцеллез:
Используют морских свинок (250-300 г) или белых мышей (17-20 г)
Исследуемый материал вводят подкожно в паховую область в дозах не
более 0,5 мл для мышей или 1,0 мл – для морских свинок
При исследовании крови или другого материала, не содержащего
посторонней микробиоты, заражение биопробных животных
производят внутрибрюшинно
Исследуемый материал вводят одновременно 6 б/мышам и 2 м/свинкам
Из 6 белых мышей 3 б/м вскрывают на 21 сут после введения материала и
3 – через 30 дней после заражения
На 30 день после заражения органы 1 морской свинки подвергают
бактериологическому исследованию
При отрицательном результате еще через 15 дней вскрывают 2-ую м/св
У биопробных животных бактериологически исследуют паховые,
аксиллярные, подчелюстные, шейные, парааортальные ավշային
հանգույցներ, печень и селезенку
0
21 с
30 с
45 с
6 б/м и 2 м/с
3 б/м
3 б/м
1 м/с
1 м/с

52.

Բրուցելոզի իմունաբանական
ախտորոշում

53.

Реакции, направленные на поиск
անտիգենов возбудителя бруцеллеза:
Ֆլուորեսցենտ հակամարմինների մեթոդ
РНГА с иммуноглобулиновым эритроцитарным
бруцеллезным диагностикумом
ТИФМ
Кольцепреципитация
ПЦР

54.

Ֆլուորեսցենտ հակամարմինների մեթոդ
(прямой вариант):
Ֆլուորեսցենտ հակամարմինների մեթոդ
(МФА) в прямом варианте используется
для выявления возбудителя в
фильтратах и центрифугатах проб
воды, почвы и молока, а также в тканях и
органах больных человека и животных
Окраску мазков проводят коммерческим
препаратом бруцеллезных
флуоресцирующих иммуноглобулинов в
рабочем титре
В качестве метки используют различные
флуоресцирующие соединения. Наиболее
распաճраненным является
флуоресцинизотиоционат (ФИТЦ)

55.

Ֆլուորեսցենտ հակամարմինների մեթոդ:
МФА применяют для исследования клинического материала от
больных людей и животных, а также проб из объектов внешней
среды, пищевых продуктов и т.д.
Использование МФА предусматривает проведение
концентрирования бактерий в нативном материале путем
центрифугирования пробы (3000 g, 20-30 мин) или ее
фильтрации через мембранные фильтры (0,22 или 0,45 мкм) с
последующим смывом осадка с поверхности фильтра
Из исследуемых проб или осадка делают мазки-отпечатки,
которые после их фиксации подвергают окрашиванию
Просмотр препарата в люминесцентном микроскопе
осуществляют не менее чем в 25 полях зрения
Специфическим считается свечение клеточной стенки на 3-4
креста, центральная часть клетки при этом остается
неокрашенной (феномен Кумбса)

56.

Մեթոդика окрашивания мазков для исследования в
прямом МФА:
На поверхность фиксированного и высушенного мазка,
помещенного во влажную камеру (чашку Петри с
влажной
фильтровальной бумагой или ватой), пипеткой наносят каплю
иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих
бруцеллезных моноклональных в рабочем разведении
Через 20 мин инкубации при комнатной температуре мазки
ополаскивают дистиллированной водой
Стекла промывают 0,15М раствором натрия хлорида два раза по 5 мин
Затем мазки ополаскивают дистиллированной водой и высушивают
на воздухе
На готовые мазки наносят каплю раствора глицерина
(9
объемных частей глицерина и 1 часть фосфатного буфера, рН 7,0),
накрывают покровным стеклом и просматривают в
люминесцентном микроскопе

57.

Разрешающая способность (զգայունություն)
МФА составляет 105-106 м.к./мл
С целью повышения чувствительности МФА разработан способ
индикации возбудителя бруцеллеза, предполагающий
предварительную инъекцию исследуемого материала биопробным
животным
При этом подкожно белым мышам в область спины вводят 0,5-0,1 мл
суспензии исследуемого материала в 0,15 М растворе хлорида
натрия, которую предварительно смешивают с
гепаринизированной արյունю в соотношении 1:0,5 – 1:0,7
К полученной смеси из расчета на одно животное можно добавить
0,5 мл куриного желтка, 5-7 мг кортизона и 90-120 мг сухого молока
Из содержимого, полученного с места введения, готовят мазки,
которые окрашивают препаратом флуоресцирующих бруцеллезных
иммуноглобулинов
Таким способом выявляют возбудителя бруцеллеза при его
минимальной концентрации в исследуемом материале

58.

РНГА с эритроцитарным бруцеллезным
иммуноглобулиновым диагностикумом:

59.

Чувствительность РНГА 105-106 м.к./мл
РНГА может быть использована при исследовании выделенных культур
микроорганизмов, а также проб как из объектов окружающей среды,
так и от больных и животных
Исследуемую пробу разливают в лунки полистироловой пластины в
объеме 0,025 мл . Первая лунка является опытной, вторая – контрольной
(РТНГА)
В опытную лунку вносят 0,025 мл нормальной кроличьей сыворотки, во
вторую – 0,025 мл иммунной сыворотки в разведении 1:10,
инактивированной при 56 0С 30 мин
Через 15-20 мин инкубации при комнатной t в обе лунки добавляют 0,025
мл 1% взвеси диагностикума, нагруженного специфическими
иммуноглобулинами
Результат реакции учитывают через 2 час и 24 час
В опытной лунке эритроциты, выпавшие «зонтиком», учитываются как
դրական արդյունք
В РТНГА должен быть բացասական արդյունք («пуговка»)
Если обе лунки «положительны», реакцию следует переставить с
разбавленной в 10 раз пробой (м.б. избыток անտիգենа)

60.

Իմունաֆերմենտային մեթոդ
Твердофазный иммуноферментный метод [ТИФМ (в настоящее время
чаще используют термин ИФА) или ELISA] отличается высокой
զգայունությունю (5•104 м.к./мл или 1 мкг/мл растворимого белкового
անտիգենа) и специфичностью
Результат анализа можно получить спустя 4-5 ч от начала исследования. С
помощью этого метода при поиске անտիգենов выявляют специфические
անտիգենные комплексы возбудителя бруцеллеза как в различных
биопробах, так и в объектах внешней среды
Для выполнения ИФА используют «Тест-систему диагностическую
иммуноферментную для определения бруцеллезного անտիգենа
иммуноферментным методом», выпускаемую предприятием по
производству бактериальных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи
РАМН (Москва) и ФКУЗ СтавропольНИПЧИ

61.

Чувствительность ТИФМ 104 м.к./мл
Сэндвич-вариант ИФА

62.

Ռեակցիա преципитации (кольцевая
проба) для исследования проб молока:

63.

ՊՇՌ՝ հատուկ նուկլեոտիդային
հաջորդականության ամպլիֆիկացիայի
մեթոդ
Используется на
Денатурация
Отжиг праймеров
Элонгация
этапах выявления АГ
Наибольшая զգայունություն – 103104 м.к./мл
Срок анализа - 4-8 час
Позволяет идентифицировать
также
Нетипичные
формы бруцелл

64.

Реакции, направленные на поиск
бруцеллезных антител в շիճուկх:
Ռեակցիա Хеддльсона
Объемная ռեակցիա агглютинации Райта
НМФА (непрямой вариант)
РНГА с անտիգենным эритроцитарным
диагностикумом
Ռեակցիա Кумбса
ОФР
ТИФМ (непрямой вариант)

65.

Մեթոդ ускоренной реакции агглютинации на стекле
(Хеддльсона) для выявления антител:
Стекло тщательно моют и
обезжиривают и расчерчивают на 6
квадратов по диагонали
Вносят в квадраты исследуемую
сыворотку в дозах: 0,04; 0,02; 0,01 и
0,02 мл (к-ль сыворотки)
К первым 3-м лункам добавляют по
0,03 мл диагностикума бруцеллезного
жидкого для РА;
В 4-ю лунку вносят 0,03 мл 0,9%
раствора NaCl
В последней лунке смешивают
диагностикум и 0,9% р-р NaCl (к-ль
диагностикума)
Стекло подогревают до 36 0С над
пламенем горелки

66.

67.

Объемная (пробирочная) ռեակցիա
Райта:
Диагностикум разводят 1:10
Готовят разведения сыворотки двукратным
шагом от 1:25 до 1:400 в объеме 0,5 мл
Контроль сыворотки проводят с разведением 1:25
В каждую пробирку, кроме контрольной, вносят по 0,5 мл диагностикума в
разведении 1:10
Контроль сыворотки проводят с о,5 мл 0,15 М раствора Na Cl
Контроль диагностикума - в 5 пробирках: смесь диагностикума,
разведенного 1:10, с 0,15 М раствора NaCl (2,0+2,0;
1,0+0;
0,75 +0,25;
0,5 + 0,5;
0,25 +0,75 соответствено
Учет реакции осуществляют через 24 час инкубации при 37 0С

68.

Учет реакции Райта:
++++ - полное просветление жидкости с образованием
осадка в виде крупно- и мелкозернистых хлопьев
+++
- почти полное просветление жидкости , хорошо
заметные хлопья
++
- незначительное просветление жидкости с
заметными хлопьями
+
-
- мутная жидкость с едва заметной зернистостью
- равномерно мутная жидкость без агглютинации

69.

Антиглобулиновая проба (ռեակցիա Кумбса):
Постановка реакции Кумбса основана на выявлении неполных антител
Для пробы Кумбса отбирают пробирки с исследуемой сывороткой, в
которых в реакции Райта зафиксирован отрицательный или слабоդրական
արդյունք
Эти пробирки центрифугируют: 3000 об/мин - 40 мин
Супернатант удаляют, осадок отмывают трижды 0,85 % раствором NaCl,
после чего к 0,5 мл отмытого անտիգենа добавляют 0,5 мл
антиглобулиновой сыворотки, используемой специально для реакции
Кумбса
Пробирки выдерживают в термостате при 37 0С в течение 18-24 ч
Учет реакции осуществляют аналогично реакции пробирочной
агглютинации Райта
Մեթոդ Кумбса принципиально не отличается от метода
иммунофлюоресценции, но последний является более пաճым

70.

Опсоно-фагоцитарная ռեակցիա (ОФР):
Ռեակցիա основана на
способности полинуклеарных
нейтрофилов фагоцитировать
бруцеллы в присутствии
специфических опсонинов,
которые нарастают в крови
человека или животного в
процессе бруцеллезной инфекции
или в связи с введением им
бруцеллезной вакцины
Ռեակցիա высокочувствительна и может применяться в комплексе с
другими диагностическими ռեակցիաми
Ее преимущества: техническая пաճота выполнения и высокий процент
(до 96%) положительных реакций при хронических формах
К недостаткам следует отнести ложноположительные реакции, особенно
во время лихорадки, или (в 6-8% случаев) появление отрицательных
проб у бруцеллезных больных
Относительно высокий фагоцитоз отмечается у лиц, которые не болели,
но сталкивались с возбудителем заболевания

71.

При добавлении կուլտուրաներ бруцелл к крови
зараженного бруцеллезом человека микробы
энергично фагоцитируются нейтрофильными
лейкоцитами вследствие наличия у них
специфических опсонинов и тропинов
Ռեակցիա учитывается путем подсчета
количества фагоцитированных бруцелл в 25
нейтрофильных лейкоцитах из нескольких
мест мазка
Показатель 10—24 характеризует слабо
положительную реакцию; 25—49 — ясно
выраженную; 50—75 — резкую
У здоровых людей показатель в большинстве
случаев составляет 0 или 1, достигая в редких
случаях 4—5

72.

Ֆլուորեսցենտ հակամարմինների մեթոդ
(непрямой вариант):
Для быстрой серологической дифференциации первых биоваров
видов B. abortus и B. melitensis, выявления диссоциированных (Rформ) бруцелл можно использовать метод флуоресцирующих
антител в непрямом варианте, при котором постановку МФА
осуществляют в 2 этапа: на первом мазок обрабатывают немеченой
бруцеллезной сывороткой, на втором – антивидовыми
флуоресцирующими иммуноглобулинами

73.

НМФА для выявления специфических
сывороточных антител:
На предварительно сделанные и фиксированные мазки,
сделанные из взвеси бруцелл 109 м.к./мл, наслаивают
исследуемую сыворотку в различных разведениях,
инкубируют 20 мин при комнатной t, после чего отмывают
и наносят антивидовые հակամարմիններ, меченные ФИТЦ
После инкубации 20 мин при комнатной t в темноте
просматривают в люминесцентном микроскопе
Реакцию иммунофлюоресценции считают
положительной при наличии специфического
свечения бруцелл с сывороткой в ее титре 1:50

74.

75.

ИФА, направленный на выявление
антител в շիճուկх:

76.

Բրուցելոզի ալերգոդիագնոստիկա
(Բյուրնեի փորձ)՝ մաշկային փորձ
Становится положительной к концу 1-го месяца от
начала инфекции в 80-90 % случаев
Иногда – с первой декады от начала болезни
Иногда сохраняется много лет и даже пожизненно
У больных хроническим бруцеллезом кожная проба
положительна в 90-95% случаев
Может отсутствовать при иммунодефицитных
состояниях или
Может быть положительной после вакцинации

77.

Ալերգիկ մաշկային փորձ
(Բյուրնեի փորձ)
Փորձ Бюрне вполне специфична и отличается
весьма высокой զգայունությունю
Определяет способность организма, зараженного
бруцеллезом, специфически отвечать местной
Техника внутрикожного
реакцией кожи на внутрикожное введение
введения бруцеллина при
бруцеллина — фильтра 3-недельного աճа
постановке пробы Бюрне
бульонной կուլտուրաներ бруцелл любого типа.
Ռեակցիա становится положительной на 3—4-й
неделе от начала болезни, но бывают случаи и более
раннего появления
В дальнейшем она сохраняется с большим
постоянством на протяжении очень длительного
периода (иногда до нескольких лет), даже после
полного клинического выздоровления

78.

При постановке реакции Бюрне
бруцеллин в дозе 0,1 мл вводят строго внутрикожно в среднюю треть ладонной
поверхности предплечья
Через 6—12 часов на месте инъекции появляется отек и покраснение, которые
достигают максимального развития через 24 и 48 часов
В редких случаях внутрикожная проба становится положительной к 72 часам — это
так называемые поздние реакции
При оценке реакции принимают во внимание, главным образом, воспалительный
болезненный отек; гиперемия кожи на месте инъекции без отека
диагностического значения не имеет. Отсутствие болезненности и изменения
цвета кожи, обычно сопровождающих отек, не исключает положительной оценки
пробы
Интенсивность реакции учитывают:
1) отрицательная ռեակցիա (—) — полное отсутствие местных изменений;
2) сомнительная ռեակցիա (±) — наличие асимметрии кожной складки по
сравнению с контрольной
3) слабо положительная ( + )—наличие слабо выраженного отека и красноты
диаметром 2—3 см
4) положительная ռեակցիա ( + + )— отечность 4—5 см, иногда с аденитом
5) резко положительная (+ + + ) —при отеке 6—8 см; аденит

79.

Комплексный сероаллергологический метод
– основа неկուլտուրաльной диагностики
бруцеллезной инфекции
на протяжении первых десяти дней заболевания ռեակցիա
Райта и проба Бюрне равноценны и выпадают
положительными приблизительно в 28% случаев
Во второй декаде заметно расхождение: ռեակցիա Райта дает до
90% положительных результатов, а
проба Бюрне –
только 63%
Бруцеллиновая проба даже в более поздние периоды инфекции
в отдельных случаях может быть отрицательной при
положительной реакции агглютинации, поэтому только
комплексное их применение обеспечит высокий процент
выявления инфекции

80.

Բրուցելոզի
հետազոտությ
ան ընդհանուր
սխեմա
ПЦР
МФА
ПЦР
НМФА

81.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!