ВКР Козлова КС — копия

1. Деградация белков c-Fos и RGS4 в 20S протеасомах

Козлова Ксения Сергеевна
Руководитель Морозов А.В.
ИМБ им. В.А. Энгельгардта,
лаб. Регуляции внутриклеточного протеолиза
Москва
2026

2. 26S и 20S протеасома

Протеасомы – мультисубъединичные белковые комплексы, которые гидролизуют
внутриклеточных белков до пептидов. Клетки содержат от 100000 до 1 млн протеасом.
большинство
Протеасомы
20S
26S
19S активатор
11 нм
15 нм
Убиквитинированные
белки
Окисленные белки
Белки с
экспонированными
гидрофобными участками
IDR, IDP
Протеасомы принимают участие в
• регуляции клеточного цикла,
• транскрипции,
• термозащите клетки,
• иммуннологических реакциях,
• нарушение в работе УПС приводит к
развитию тяжелых патологий.
2

3. Модуляция NMDA-зависимой сигнализации и экпрессии генов

В мембранах нейронов были выявлены
встроенные 20S протеасомы NMP (Neuronal
membrane
proteasome)
разрушающие
внутриклеточные белки с образованием
пептидов,
высвобождающихся
во
внеклеточную среду и модулирующих
активность NMDA-рецепторов. С помощью
масс-спектрометрии
идентифицировано
>100 потенциальных белков-субстратов
NMP.
Однако,
конкретные
пептиды,
модулирующие
активность
NMDA
рецепторов на сегодняшний день не
определены.
Türker F, Brennan A, Margolis SS. Neuronal membrane proteasome-derived peptides modulate
NMDAR-dependent neuronal signaling to promote changes in gene expression. Mol Biol Cell. 2024
Ramachandran KV, Fu JM, Schaffer TB, Na CH, Delannoy M, Margolis SS. Activity-Dependent Degradation
of the Nascentome by the Neuronal Membrane Proteasome. Mol Cell. 2018
3

4.

Цель и задачи работы
Цель работы
Разработать клеточные линии для экспрессии и аффинной очистки белков-субстратов
NMP и изучить деградацию рекомбинантных белков c-Fos и RGS4 в 20S протеасомах.
Задачи работы
1. Разработка лентивирусных векторов для введения в геном клеток HEK293T последовательностей,
кодирующих белки c-Fos и RGS4 мыши, слитые с тегом, обеспечивающим их аффинную очистку;
2. Трансдукция клеток HEK293T полученными лентивирусными препаратами, сортировка
редактированных клеток;
3. Валидация клеточных линий: оценка наличия вставок в геном, уровней экспрессии химерных генов и
накопления белков в клетках;
4. Анализ протеасомной деградации и стабильности белков в клетках;
5. Аффинная очистка белков RGS4 и c-Fos из модифицированных клеточных линий;
6. Оценка эффективности деградации очищенных белков RGS4 и c-Fos в 20S протеасомах;
7. Анализ влияния продуктов деградации белков на активность NMDA-рецепторов нейронов мышей.
4

5. В качестве белков-мишеней выбраны с-Fos и RGS4

В качестве белков-мишеней выбраны с-Fos и RGS4
Среди потенциальных субстратов NMP были выбраны 2 белка - c-Fos и Rgs4.
Необходимым условием деградации белка в 20S протеасоме является наличие внутренне
неупорядоченных участков (IDR).
Анализ IDR с помощью IUpred2A
c-Fos
Продукт
гена
раннего ответа и
протонкоген,
транскрипционный
фактор.
RGS4
Регулятор
G-белкового
сигналинга
5

6. Разработаны лентивирусные векторы; проведено редактирование генома клеток НЕК293Т

Разработаны лентивирусные векторы; проведено редактирование генома
EcoRI и
клеток НЕК293Т
BamHI
NheI
1 кб
100+ п.о.
RGS4
На основе вектора LeGO-iG2, разработаны две
генетические конструкции, кодирующие белки c-Fos и
RGS4 мыши, слитые с HTBH последовательностью.
c-Fos
RGS4
c-Fos
1918
IG2-c-Fos
Рестрикционный
анализ плазмид
1146
621
621
357
357
1415
1415
357
IG2-Rgs4
Рестрикция по BamHI; EcoRI и NheI
Используя разработанные векторы, были
получены
препараты
псевдовирусов
и
проведена трансдукция клеток HEK293T. После
сортировки клеток по флуоресценции GFP
были получены новые клеточные линии
HEK293T IG2-c-Fos и HEK293T IG2-RGS4.
HEK293T IG2-c-Fos
HEK293T IG2-RGS4
200 нм
200 нм
200 нм
200 нм
200 нм
200 нм
HEK293T
6

7. Разработаные клеточные линии, которые экспрессируют химерные белки

В клетках HEK293T IG2-c-Fos и HEK293T IG2-RGS4 показано наличие в ставки в геном и
экспрессия целевых химерных белков.
ПЦР с геномной ДНК
Иммуноблотинг
53 кДа
35 кДа
100
п.о. +
375 п.о.
53 кДa
35 кДа
385 п.о.
310 п.о.
ПЦР в реальном времени
Относительный уровень
экспрессии мРНК, %
α – c-Fos
α – RGS4
100
п.о.+
α – RGS4
(длинная экспозиция)
35 кДа
α – c-Fos
(длинная экспозиция)
53 кДа
Стрептавидин - HRP
42 кДа
Стрептавидин - HRP
42 кДа
α – β-актин
α – β-актин
В клетках показана высокая экспрессия
химерных генов, а также значительное
накопление целевых белков.
7

8. Белки c-Fos и RGS4 достаточно стабильны в модифицированных клетках

Характеристику стабильности химерных белков в клетках проводили с помощью
ингибиторного анализа и циклогексимидной гонки.
Анализ накопления в присутствии MG132
Анализ стабильности в присутствии
циклогексимида
HEK293T IG2-c-Fos
23 кДа
41 кДа
α - c-Fos
42 кДа
α - β-актин
Часы 0 2 4 6 8
41 кДа
α – RGS4
42 кДа
α - β-актин
И c-Fos и RGS4 практически не
разрушаются
в
протеасомах
модифицированных клеткок.
HEK293T IG2-RGS4
0 2 4 6 8
23 кДа
α - c-Fos
42 кДа
α – RGS4
42 кДа
α - β-актин
α - β-актин
Период
полужизни
белков
составляет более 6 часов.
8

9. Из клеток были очищены целевые химерные белки

Иммуноблотинг образцов на
различных этапах выделения белков
Гомогенизация
клеток при помощи
гриндера
HTBHтег
53 кДа
42 кДа
Клетки HEK293T IG2c-Fos и HEK293T IG2RGS4
Инкубация гомогената со
стрептавидин-агарозой
α – c-Fos
35 кДа
23 кДа
Обработка TEVпротеазой
Очищенные
белки
α – Rgs4
9

10. Белки c-Fos и RGS4 разрушаются в 20S протеасомах после аффинной очистки

Очищенные рекомбинантные белки инкубировали с коммерческими препаратами 20S
протеасом разные промежутки времени.
c-Fos+20S
c-Fos
Часы
2
4
6 24 48
2
4
6
24 48
c-Fos + 20S + MG132
4
2
6
24 48
41 кДа
α - с-Fos
α - с-Fos
α - с-Fos
23 кДа
Часы
23 кДа
α – α 1, 2, 3, 5, 6, 7
α – α 1, 2, 3, 5, 6, 7
α – α 1, 2, 3, 5, 6, 7
RGS4
RGS4+20S
RGS4 + 20S + MG132
2
4
6
24 48
2
4
6
24 48
2
4
6 24 48
α – RGS4
α – RGS4
α – RGS4
α – α 1, 2, 3, 5, 6, 7
α – α 1, 2, 3, 5, 6, 7
α – α 1, 2, 3, 5, 6, 7
41 кДа
При инкубации белков с
препаратом
коммерческих
20S протеасом выявлено, что
белок
c-Fos
разрушается
через 4 часа после начала
инкубации.
При
этом,
наблюдается
существенное
замедление его деградации в
присутствии
ингибитора
протеасом MG132. Напротив,
частичная деградация RGS4
была обнаружена только
после 24-часовой инкубации с
препаратом протеасом.
10

11. Продукты деградации белков c-Fos и RGS4 модулируют активность NMDA-рецепторов

Инкубация с 20S
протеасомой (24ч)
Флуоресцентный
кальциевый
индикатор Fluo-4 AM
Фильтрац
ия через
мембрану
3к
Добавление фильтрата к
нейронам мыши
Продукты деградации белка RGS4 и в меньшей
степени с-Fos способствуют модуляции Ca2+ тока
в нейронах.
11

12.

Продукты деградации белков c-Fos и RGS4 модулируют активность
NMDA-рецепторов
Показано увеличение входа Ca 2+ в нейроны под действием продуктов деградации белка RGS4.
На фоне стимуляции клеток продуктами деградации RGS4 не наблюдается дальнейшая активация входа Ca 2+ в
нейроны после добавления NMDA.
12

13.

Потенциальные продукты деградации белков c-Fos и RGS4
c-Fos
RGS4
Возможное применение
156 возможных пептидов
• MMFSGFNADYEASSSRC
• SSASPAGDSLSYYHSPADS
• APHPYGLPTQSAGAYAR
• AGMVKTVSGGRAQSIGR
• RGKVEQLSPEEEEK
• RRIRRERNKMAAAKCRNRRRE
• LTDTLQAETDQLEDEKS
• ALQTEIANLLKEKEK
• LEFILAAHRPACKIPDDLGFPEEM
SVASLDLTGGLPEASTPESEEAFT
• EPLCTPVVTCTPGCTTYTSSFVFT
YPEADSFPSCAAAHRK
• …
94 возможных пептида
• MCKGLAGLPAS
• CLRSAKDMK
• HRLGFLLQK
• SDSCEHSSSHSK
• DKVVTCQRVSQEEVK
• KWAESLENLIHHECGL
• KSEYSEENIDFWIS
• CEYKKIKSPSKLSPKAKKIYNEFISVQA
TK
• EVNLDSCTREETSR
• EKDSYRRFLK
• SRFYLDLTNPSSCGAEK
• ...
Препараты для
• анестезии
• лечения деменции,
• болезни Паркинсона,
• последствий черепно-мозговой
травмы,
• депрессии,
• ишемии,
• болезни Альцгеймера,
• Шизофрении
• и т.д…
Источник: NetChop 3.1 - DTU Health Tech - Bioinformatic Services
13

14. Выводы

• Разработаны две новые клеточные линии HEK293T IG2-c-Fos и HEK293T
IG2-RGS4. Полученные клетки-продуценты являются удобными
инструментами для экспрессии и аффинной очистки белков c-Fos и
RGS4 мыши.
• Показано, что белки c-Fos и RGS4 стабильны в клетках HEK293T IG2-cFos и HEK293T IG2-RGS4, соответственно.
• Выявлено, что полученные из клеток-продуцентов высокоочищенные
препараты белков c-Fos и RGS4 разрушаются при инкубации с
коммерческим препаратом 20S протеасом.
• Продукты деградации белка RGS4 и в меньшей степени белка c-Fos
стимулируют вход Са2+ в нейроны.
14

15.

Благодарности
• Алексею Владимировичу Морозову — за руководство, помощь в выполнении работы и
интерпретации результатов, редактуру текста,
• Александру Валерьевичу Бурову — за помощь в освоении методов молекулярной и клеточной
биологии,
• Вадиму Львовичу Карпову — за возможность выполнения работы в лаборатории,
• Ирине Юрьевне Петрушанко и Денису Романовичу Лисицкому — за помощь в экспериментах на
клеточных культурах нейронов,
• Наталье Петровне Шаровой — за рецензирование работы,
• Ольге Игоревне Карповой, Сергею Владимировичу Разину и Татьяне Сергеевне Калебиной — за
ценные замечания при подготовке диплома.
15

16. Пептид-зависимая комуникация нейронов

В мембранах нейронов были выявлены 20S протеасомы NMP (Neuronal membrane
proteasome) разрушающие внутриклеточные белки с образованием пептидов,
высвобождающихся во внеклеточную среду.
Ramachandran KV, Margolis SS. A mammalian nervous-system-specific plasma membrane proteasome complex that modulates neuronal
function. Nat Struct Mol Biol. 2017
16

17. Субстраты NMP

RGS4: Ускоряет инактивацию G-белков, действуя
как GTPase-активирующий белок.
c-Fos: Компонент фактора транскрипции AP-1.
Регулирует рост, деление и дифференцировку
клеток.
Npas4: Транскрипционный фактор, участвует в
нейропротекции.
Snurf: Участвует в регуляции транскрипции,
взаимодействуя с рецепторами стероидов и
фактором Sp1.
Cic: Транспортирует цитрат из митохондрий в
цитозоль, связывает метаболизм с регуляцией
экспрессии генов .
Egr1: Транскрипционный фактор, фактор
немедленного раннего ответа. Запускает
воспаление, рост клеток и апоптоз в ответ на
стресс.
Ramachandran KV, Fu JM, Schaffer TB, Na CH, Delannoy M, Margolis SS. Activity-Dependent Degradation of the Nascentome by the
Neuronal Membrane Proteasome. Mol Cell. 2018
17

18. Белки c-Fos и RGS4 разрушаются в 20S протеасомах после аффинной очистки

Относительная оптическая плотность
Белки c-Fos и RGS4 разрушаются в 20S протеасомах
после аффинной очистки
18

19. Валидация праймеров для ПЦР в реальном времени

c-Fos
100 bp+
c-Fos ms
RGS4
RGS4 ms
Actin
100 bp+
Была показана высокая
специфичность праймеров
к заданной матрице.
19