Методы оценки белковой экспрессии. ИФАанализ, Вестерн блоттинг, иммуноприципитация, иммуногистохимия

1.

Методы оценки белковой экспрессии. ИФАанализ, Вестерн блоттинг, иммуноприципитация,
иммуногистохимия.
Д.м.н. Н.В. Юнусова
ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН, г.Томск
ГОУ ВПО СибГМУ, г.Томск

2.

Актуальность.
Целью многих генно-инженерных исследований является создание
рекомбинантных молекул ДНК, содержащих гены, которые должны
экспрессироваться в клетках-реципиентах.
Наиболее часто используемыми методами
оценки белковой экспрессии являются
иммуноферментный анализ и Вестерн
Блоттинг.
Также используются иммуногистохимия, иммунофлюореценция и иммунопреципитация.

3.

ИФА
ИФА – иммунохимический метод анализа,
заключающийся в выявлении антигенов (Аг) с
помощью специфичных к ним антител (Ат); при этом
один из участников иммунологической реакции
конъюгирован с ферментом-меткой.
Данный метод основывается на принципиальном
научном открытии, заключающемся в способности
комплекса антитело–фермент (Ат*) или антиген–
фермент (Аг*) сохранять функциональную
активность каждого компонента, т.е. расщеплять
субстрат и связывать антигены/антитела.

4.

ИФА
гомогенный
конкурентный
Гетерогенный
(твердофазный)
неконкурентный

5.

Конкурентный ИФА
Прямой конкурентный - используются иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела,
а меченый ферментом и немеченый антиген конкурируют за связь с иммобилизованным антителом.
К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество
и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют
и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют
ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов.
Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.
В непрямом конкурентном ИФА на поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок
стабилизатор, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную
концентрацию немеченых специфических антител,
инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов
добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител.
После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность
образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов,
причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого
антигена.

6.

Неконкурентный ИФА
«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов,
на поверхности которых существуют,
по крайней мере, две антигенные детерминанты.

7.

Ферменты для ИФА
Пероксидаза хрена
Тетраметилбензидин
Щелочная фосфатаза
Диаминобензидин
ИФА - метод количественный,
им можно определить гаптен, белок, антитело.

8.

Представление результатов ИФА
Графики (вертикальные,
Таблицы
горизонтальные,круговые диаграммы
Диаграммы рассеяния – данные корреляционного анализа
r=0,72, p<0,05
r=-0,40, p<0,05
22
100
20
90
активность 26S пула протеасом
18
16
PAPP-A, нг/мг
14
12
10
8
6
4
80
70
60
50
40
30
20
2
10
0
-2
0
5
10
15
20
25
NFkappaB (p65)
30
35
40
45
Регрессия
95% дов ер.
0
-20
0
20
40
60
NFkappaB (p50)
80
100
120
регрессия
95% дов ер.

9.

Спектр биологических жидкостей для ИФА –
сыворотка/ плазма крови, слюна, спинномозговая жидкость,
экссудаты, супернатанты тканей. Основное требование –
сохранность четвертичной структуры белка.
Ошибки при выполнении ИФА
Несоблюдение температурного и временного режима,
многоразовая пластиковая посуда
Повторное замораживание-размораживание проб
Неправильные промывки
Неправильное построение калибровочной кривой
Если уровень маркера в пробе не попадает в калибровку, его нужно развести и переделать

10.

Вестерн Блоттинг
WB – аналитический метод, используемый для определения
специфичных белков в образце.
На первом этапе (пробоподготовка и электрофорез белков)
для разделения смеси белков используется
1D-электрофорез в полиакриламидном геле по Lemmli.
На втором этапе - собственно блоттингпод действием капиллярных сил происходит перенос белков
с геля на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану
На третьем этапе проводят блокирование неспецифического связывания,
что достигается помещением мембраны в разбавленный раствор нежирного сухого
молока с детергентами
4-й этап – окрашивание мембраны специфическими антителами, отмывка
5-й этап – окрашивание мембраны вторичными антивидовыми
коньюгированными антителами
6 – детекция целевого белка.

11.

Первый этап – пробоподготовка и электрофорез
Приготовление осветленных гомогенатов тканей, смешивание осветленных
гомогенатов с буфером с глицерином, бромфеноловым синим и SDS,
денатурация белка (нагревание проб при 95 градусах в течение 5-7 мин.)
При использовании 1D-электрофореза белков в полиакриламидном геле по Лемли обычно
исходят из следующих допущений:
- белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
- количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине,
и, следовательно, молекулярной массе;
- собственный заряд полипептида несущественен в сравнении
с зарядом связанного с ним SDS.
Вместе с образцами на гель наносят белок-маркер молекулярной массы

12.

Третий этап – блокирование неспецифического
связывания на PVDF-мембране
Достигается помещением мембраны в разбавленный раствор
нежирного сухого молока с детергентом
Четвертый этап – окрашивание первичными
специфическими антителами (от 20 минут до over night) с
последующей отмывкой
Пятый этап – окрашивание мембраны вторичными антивидовыми
коньюгированными антителами
Вторичные антитела в WB могут бытьконьгированы с пероксидазой хрена,
с биотином, с флюорохромом, с радиоактивной меткой

13.

Пятый этап – детекция.
Наиболее часто используется хемилюминесцентный метод детекции –
Хемилюминесцентная система визуализации
Пероксидаза хрена катализирует окисление люминола в 3-аминофталат
через серию интермедиатов.
Данная реакция сопровождается свечением низкой интенсивности с длиной волны 428 нм.
В присутствии некоторых веществ, возможно достичь усиления свечения до тысячи раз.
Явление усиления свечения называют усилением хемилюминесценции
(англ. enhanced chemiluminescence, ECL).

14.

WB – метод полуколичественный !
Проводится перерасчет на актин (структурный белок,
до 20% от всех белков в клетке) и часто на норму,
неизмененную ткань т.д., уровень детектируемого белка
Определяется в % от нормы, неизмененной ткани,
усредненной ткани, иногда результаты описываются как для
иммуногистохимии (-/+/++/+++).

15.

Форма представления
результатов
исследования WB

16.

Сопоставление клинических параметров в зависимости от
выраженности асцита
Выраженный асцит
N = 84
Невыраженный асцит
N = 65
Значение
р
57,3 (31,4-88,1)
60,7 (26,7-83,6)
0,1
IIIa
4 (4,8%)
6 (9,2%)
IIIb
6 (7,1%)
4 (6,2%)
IIIc
60 (71,4%)
50 (76,9%)
IV
14 (16,7%)
5 (7,7%)
Агрессивная
22 (26,2%)
23 (35,4%)
Неагрессивная
62 (73,8%)
42 (64,6%)
Полная
25 (29,8%)
41 (63,1%)
Оптимальная
23 (27,4%)
15 (23,1%)
Субоптимальная
36 (42,9%)
9 (13,9%)
27,5 (0,3-108,4)
27,3 (0,5-96,8)
Живы
43 (51,2%)
49 (75,4%)
Погибли
41 (48,8%)
16 (24,6%)
Время от операции
до смерти 25%
пациенток
25
33,7
Медиана
продолжительности
жизни
38,2
Медиана не достигнута
Возраст
Стадия FIGO
Первичная
циторедукция
Характер
циторедукции
Время наблюдения
Статус на данный
момент
0,13
0, 28
<0,0001
-
-
0,009
16
Feigenberg T., Clarke B., Virtanen C. et. al., 2014

17. Экспрессия 20S протеасом у больных раком яичников

следы
асцита
<1
литра
>1
литра
12
7
6
5
4
3
2
1
0
10
8
плазма
асцит
ПОЯ
6
4
2
ПО
0
плазма
ПОЯ
плазма
асцит
Рак яичников
асцит
20S
20S
CD9
CD9
Следы
асцита
<1
>1
литра литра

18. Экспрессия 20S протеасом у больных колоректальным раком

2,5
3
2
локализованный
КРР
местнораспространенный
2
1,5
контроль
1
первичнодиссеминированны
й
контроль
1
0,5
0
0
плазма
контро
ль
КРР
20S
20S
CD9
CD9
Л М П-Д

19.

Оборудование для WB
Система визуализации
WorkFlow
Сочетает в себе принципы
хемилюминесцентной и
флюоресцентной детекции
белка при WB

20.

iBind™ Western Device
The membrane was blocked with 1X
iBind Solution (Invitrogen, USA).
Primary antibody to 20S proteasomes
(Anti-Proteasome 20S alpha+beta
antibody ab22673, Abcam, UK, dilution
1:2000) binding, washing, secondary
antibody (goat anti-rabbit IgG-HRP,
Santa Cruz Biotechnology, 1:5000
dilution) binding (1/5000 dilution) and
washing were performed using an
automated Western blotting device
iBind Western Device (Thermo
Scientific, USA) for 3 hours.

21.

ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИЯ
Иммунопреципитация – метод выделения белка из сложных смесей,
таких как клеточные лизаты, сыворотки, тканевые гомогенаты
с помощью специфических к белку антител, сорбированных на
гранулах (микрогранулы агарозы, латекса, магнитные микрогранулы).
Ко-иммунопреципитация - это иммунопреципитация целого белкового комплекса,
которая основана на использовании антитела, специфичного к одному из белков,
входящих в состав комплекса. Связывая этот белок, антитело связывает весь комплекс.
В результате появляется возможность идентифицировать
все белки, входящие в состав комплекса.
Иммунопреципитация часто дополняется Вестерн блоттингом или ИФА-анализом.

22.

ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИИ
Выделение белковых комплексов
WB, ELISA на супернатантах тканей
- качественное и количественное
идентификация белков в выделенных
иммунокомплексах

23.

ЗНАЧЕНИЕ БЕЛКОВ В СОСТАВЕ ПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ
IGF-IR в виде субъединичного
комплекса на мембране в
cвязи со своим лигандом IGF-I
или IGF-II (сорбция на
гранулах с phospho IGF-IR)
Индукция клеточной
пролиферации
и подвижности
(во всех клетках)
IGF-IR в составе
катенин-кадгеринового
комплекса
(сорбция на E- кадгерине)
Активация клеточной
адгезии и снижение
подвижности
IGF-IR в составе
комплекса с рецептором
Адипонектина
AdipoR1 и APPL1
(сорбция на APPL1)
Индукция пролиферации
в клеточных линиях ER+
рака молочной
железы (для др. типов
Рака – неизучено)

24.

Иммуногистохимия –
выявление тканевых антигенов с помощью
специфичных антител,
при этом один из участников иммунологической реакции
коньюгирован с ферментом-меткой. Принцип метода
аналогичен ИФА.
Достоинства иммуногистохимии – возможно выявить
распределение антигена в строме/паренхиме,
в различных структурах ткани, ядерное/цитоплазматическое
типирование.
Иммунофлуоресценция – выявление тканевых/клеточных
антигенов с помощью флюоресцентной метки.
Варианты – с использованием красителей, соединенных
с флюорохромом, с использованием антител, соединенных
с флюрохромом.

25.

ИГХ метод в практической онкологии.
В клиническом аспекте метод ИГХ анализа на современном этапе позволяет:
1) осуществлять гистогенетическую диагностику опухолей;
2) определять нозологический вариант новообразования;
3) выявлять первичную опухоль по метастазу с неизвестным первичным очагом;
4) определять прогноз опухолевого заболевания;
5) определять злокачественную трансформацию клеток;
6) определять возможности таргетной терапии;
7) выявлять как резистентность, так и чувствительность
опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам;
8) определять чувствительность опухолевых клеток к
лучевой терапии.

26.

Заключение.
Многочисленность методов и подходов к оценке
белковой экспрессии обусловлена сложностью
задач в биотехнологических и молекулярнобиологических исследованиях.
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!