Морские+почвенные продуценты

2.

E.coli JW5503 (dtolc) с плазмидой pdualrep2
В качестве контролей нанесены Эритромицин (Еry, 5мг/мл, 2мкл) и Ципрофлоксацин (Cip, 25мкг/мл, 2мкл).

3.

E.coli lptDmut с плазмидой pdualrep2
В качестве контролей нанесены Эритромицин (Еry, 5мг/мл, 2мкл) и Ципрофлоксацин (Cip, 25мкг/мл, 2мкл).

Описание репортерной системы
Репортерная система описана в этой
статье https://istina.msu.ru/publications/article/31005039/.
В системе pDualrep2 акодированы белок turboRFP (красный флуоресцентный белок) и
белок Katushka2S (дальний красный флуоресцентный белок). Экспрессия белка Katushka2S
увеличивается в присутствии антибиотиков, подавляющих трансляцию, так как перед
геном флуоресцентного белка располагается регуляторный участок, сделанный на основе
лидерного пептида триптофанового оперона. В природе скорость синтеза этого лидерного
пептида определяется количеством триптофана, и если триптофана много, то
расположенные за ним гены биосинтеза не экспрессируются. Мы заменили
триптофановые кодоны на аланиновые, которые всегда транслируются быстро, и, таким
образом, только в случае торможения трансляции в присутствии антибиотика будет
экспрессироваться ген флуоресцентного белка Katushka2S, который мы поместили за
модифицированным аттенюатором. Экспрессия второго репортерного гена, RFP,
увеличивается в присутствии антибиотиков, вызывающих повреждение ДНК. Для этого
промотер белка SulA, количество которого в клетке возрастает при SOS-ответе, был
помещен перед кодирующей область белка RFP. Увеличение экспрессии флуоресцентных
белков происходит в зонах сублетальной концентрации, т.е. когда антибиотик убить клетку
не может, но уже оказывает воздействие на мишень. Для тестируемых веществ заранее
неизвестна летальная для клеток концентрация, поэтому целесообразно проводить анализ,
нанося небольшую каплю максимально возможной концентрации на чашку с агаром, на
которую был добавлен репортерный штамм. Таким образом, вокруг точки добавления
будет создан градиент концентрации за счет диффузии, и на некотором расстоянии от
точки нанесения будет зона сублетальной концентрации
Описанный выше репортер создан для клеток E. coli, однако, как представитель граммотрицательных бактерий, этот штамм не восприимчив ко многим молекулам, которые,
например, могут ингибировать грамм-положительные бактерии. Чтобы решить эту
проблему предполагается использовать два штамма E.coli – с делецией гена tolC,
отвечающего за активный экспорт (эффлюкс) антибиотиков из клетки, а также с мутацией
в гене белка LptD – такие бактерии имеют нарушение в составе клеточной стенки и будут
восприимчивы к крупным, в первую очередь пептидным антибиотикам.
Рисунок 1. А. Карта репортерной плазмиды pDualrep2.
Б. Пример использования репрортерной системы на
примере штамма E.coli ∆tolC pDualrep2, эритромицин
(Ery) вызывает индукцию синтеза флуоресцентного
белка Katushka2S в зоне сублетальных концентраций –
красный сигнал, левофлоксацин (Lev) вызывает
индукцию синтеза флуоресцентного белка RFP –
зеленый сигнал. В. Схематичное изображение
ключевых элементов двойной репортерной системы
(промоторы обозначены стрелочками, терминаторы –
вертикальными чертами).
4

5.

Результаты теста
Тип
образца
Название
Номер
образца
Экспедиция
Дата отбора
природного
образца
Вид
природного
образца
почвенны
й
2
68 ж
13 (Kerzhensky
Reserve 3 2022)
18.08.2022
почва
почвенны
й
6
89 ж
13 (Kerzhensky
Reserve 3 2022)
18.08.2022
почва
почвенны
й
8
53 ж
13 (Kerzhensky
Reserve 3 2022)
18.08.2022
почва
почвенны
й
11
29_67
12 (Bryansk Forest
Reserve 2022)
03.08.2022
почва
Название
локации
Тип сообщества для
отбора
посева
природно
го
образца
Координаты
отбора
природного
образца
бактерия
dtolc
lptD
Kerzhensk 56,496 N, 44,803 Paenibacil
y Reserve
E
lus sp.
++
Торф >30 см. 25 см Kerzhensk 56,511 N, 44,841 Bacillus
сфагнум, ниже осока. y Reserve
E
velezensis
++
Торф >30 см.
Аллювиальная
дерновая.
Kerzhensk 56,496 N, 44,807 Bacillus
y Reserve
E
velezensis
Луговая аллювиально- Брянский
кислая почва.
лес
52,44961 N,
33,86251 E
+,
потенци
альный
Lysinibacil ингибито
lus sp.
р
биосинт
еза
белка
++
комментарий
Убивает lptDmut штамм
без индукции, нужно
вырастить этот штамм в
жидкой среде.
Убивает lptDmut штамм
без индукции, нужно
вырастить этот штамм в
жидкой среде.
Убивает lptDmut штамм
без индукции, нужно
вырастить этот штамм в
жидкой среде.
Нужно вырастить этот
образец в жидкой среде.
Ингибиотры биосинтеза
белка нас интересуют
больше всего

6.

2024-03-07
Морские+почвенные продуценты

7.

E.coli JW5503 (dtolc) с плазмидой pdualrep2
Тест морских образцов
В качестве контролей нанесены Эритромицин (Еry, 5мг/мл, 2мкл) и Ципрофлоксацин (Cip, 25мкг/мл, 2мкл).
E.coli lptDmut с плазмидой pdualrep2

8.

E.coli JW5503 (dtolc) с плазмидой pdualrep2
Тест почвенных образцов
В качестве контролей нанесены Эритромицин (Еry, 5мг/мл, 2мкл) и Ципрофлоксацин (Cip, 25мкг/мл, 2мкл).
E.coli lptDmut с плазмидой pdualrep2

9.

Результаты тестов
Тип образца
морской
морской
Номер
3
4
Название образца
ОА-Lam#2
27 RHo 1
Экспедиция
4 (Franz Joseph 2021)
4 (Franz Joseph 2021)
Дата отбора
природного образца
31.08.2021
01.09.2021
Вид природного
образца
Laminaria
Rhodóphyta
Тип сообщества для посева
бактериальные биопленки с поверхности водорослей
бактериальные биопленки с поверхности водорослей
морской
10
OA_Lam 5
4 (Franz Joseph 2021)
31.08.2021
Laminaria
бактериальные биопленки с поверхности водорослей
морской
11
DV 87
19 (Vladivostok Sea of
Japan 2016)
2021
морская вода
морская вода
почвенный
почвенный
почвенный
почвенный
почвенный
2
6
8
9
11
68 ж
13 (Kerzhensky
Reserve 3 2022)
89 ж
13 (Kerzhensky
Reserve 3 2022)
53 ж
29_140
29_67
13 (Kerzhensky
Reserve 3 2022)
12 (Bryansk Forest
Reserve 2022)
12 (Bryansk Forest
Reserve 2022)
18.08.2022
18.08.2022
18.08.2022
03.08.2022
03.08.2022
почва
почва
почва
почва
почва
Торф >30 см.
Торф >30 см. 25 см сфагнум, ниже осока.
Аллювиальная дерновая.
Дерново-подзолистая песчаная на флювиогляциальных песках.
Луговая аллювиально-кислая почва.
Название локации
Координаты отбора
отбора природного
природного образца
образца
о. Аполлонова
81.1827 N, 58.1463 E
бактерия
dtolc, 01.03.23
lptD, 01.03.23
комментарий
dtolc, 07.03.23
Pseudoalteromonas
Каньон к северу от о.
81.2168 N, 58.1741 E
Аполлонова
о. Аполлонова
81.1827 N, 58.1463 E
Pseudoalteromonas
43.115536 N,
131.885485 E
Kerzhensky Reserve
Kerzhensky Reserve
Kerzhensky Reserve
Брянский лес
Брянский лес
56,496 N, 44,803 E
56,511 N, 44,841 E
56,496 N, 44,807 E
52,45089 N, 33,85326
E
52,44961 N, 33,86251
E
Paenibacillus sp.
Bacillus velezensis
Bacillus velezensis
++
Убивает lptDmut
штамм без
индукции, нужно
вырастить этот
штамм в жидкой
среде.
++
Убивает lptDmut
штамм без
индукции, нужно
вырастить этот
штамм в жидкой
среде.
++
Убивает lptDmut
штамм без
индукции, нужно
вырастить этот
штамм в жидкой
среде.
Pseudomonas sp.
Lysinibacillus sp.
+, потенциальный
ингибитор
биосинтеза белка
Нужно вырастить
этот образец в
жидкой среде.
Ингибиотры
биосинтеза белка
нас интересуют
больше всего
+
lptD, 07.03.23
комментарий
++
Убивает lptDmut
штамм без
индукции в #3,
нужно вырастить
этот штамм в
жидкой среде.
++
Убивает lptDmut
штамм без
индукции в #3,
нужно вырастить
этот штамм в
жидкой среде.
++
Убивает lptDmut
штаммы без
индукции в 2х
вариантах
культивации,
нужно вырастить
этот штамм в
жидкой среде.
+
Есть небольшая
зона в #3
+
Убивает lptDmut и
dtolc штаммы без
индукции, нужно
вырастить этот
штамм в жидкой
среде.
+
Убивает lptDmut
штамм без
индукции, нужно
вырастить этот
штамм в жидкой
среде.
+
Убивает lptDmut
штамм без
индукции, нужно
вырастить этот
штамм в жидкой
среде.
+
Убивает dtolct
штамм без
индукции, нужно
вырастить этот
штамм в жидкой
среде.
+
Убивает dtolct
штамм без
индукции, нужно
вырастить этот
штамм в жидкой
среде.

Морские+почвенные продуценты

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.