13.48M

Category:

biology

Летняя практика по генетике. Генетический аппарат клетки

1.

Летняя практика по генетике
Генетический аппарат клетки

Prokaryotes vs Eukaryotes
Прокариоты
Эукариоты
Одноклеточные
Ядра нет
Одно- или
многоклеточные
Выраженное ядро
Нет органелл
Различные органеллы
Одна кольцевая ДНК
Хромосомы
мРНК не модифицируется Посттранскрипционная
модификация мРНК

3.

Prokaryotes vs Eukaryotes
Прокариоты
Эукариоты
Геном E.coli – около
4 млн. п.о.
90% ДНК – кодирует
белки
Геном человека – около
3000 млн.п.о.
3% ДНК кодирует белки
Нет упаковки ДНК
ДНК упаковывается
гистоновыми белками и
имеет несколько уровней
упаковки

4.

Сколько ДНК имеют различные
организмы?
Организм
T4 Bacteriophage
HIV
гаплоидный геном (п.о.)
168,900
9,750
E. coli
4,639,221
Дрожжи
13,105,020
Лилия
36,000,000,000
Амеба
290,000,000,000
Лягушка
3,100,000,000
Человек
3,400,000,000

5.

Центральная догма молекулярной
биологии
Один ген – один белок?
Один ген – одна биомолекула?
Что такое экспрессия гена?
Рибосомы
ДНКзависимая
ДНК
полимераза
ДНК-зависимая РНК
полимераза
РНК-зависимая ДНК
полимераза (обратная
транскриптаза

6.

Особенности реализации наследственной
информации
Геном
Хромосомная ДНК
Плазмидная ДНК
Митохондриальная ДНК
Пластидная ДНК
Транскриптом
Протеом

7.

Нестабильность генома
Геном
Мутации собственной ДНК
Трансфекция (экзоДНК)
Трансформация (плазмиды)
Трансдукция (вирусы)
Транскриптом
Протеом

8.

Транскрипционные и
посттранскрипционные процессы
Геном
Транскриптом
Вырезание интронов и
альтернативный сплайсинг
Полиаденилирование
Транспорт из ядра
Интерференция РНК
Атака РНКаз
Протеом

9.

Протеом - набор экспрессируемых белков в
данном типе клеток или организма, в данное
время, при определенных условиях
Геном
Транскриптом
Протеом
Альтернативные точки
инициации
Гликозилирование
Частичный протеолиз

10.

Гены – лишь малая часть генома эукариот

11.

Тест Эймса – генетический
тест для оценки
мутагенности веществ

12.

13.

• Исследование мутагенности вещества проводится на этапе
доклинического изучения его безопасности
• Изучение мутагенности на млекопитающих требует усилий,
затрат и времени, в то время как ТЭ позволяет быстро и недорого
отобрать возможные мутагены для их дальнейшего изучения
• Тест Эймса учитывает генные мутации к прототрофности по
гистидину

14.

Тест-объект
• Гистидинзависимые ауксотрофные
штаммы Salmonella Typhimurium
• Штаммы несут мутацию замены
оснований (ТА 100 и ТА 102) или сдвига
рамки считывания (ТА 98)
гистидинового оперона
• Делеция гена uvrB приводит к
нарушению эксцизионной репарации
• Мутация rfa увеличивает
проницаемость клеточной стенки
• Плазмида rKM101 кодирует
устойчивость к ампицилину
• В целом повышение чувствительности
ТЭ идет за счет конструирования новых
штаммов

15.

Протокол эксперимента
• В расплавленный полужидкий агар вносят суспензию бактерий,
раствор испытуемого вещества (возможен вариант с дисками),
активирующую смесь
• Смесь наслаивают на нижний селективный агар в чашки
• Инкубируют при 37°С 48 часов и учитывают количество колоний
ревертантов от ауксотрофности по гистидину к прототрофности
• Если вещество мутагенно, количество ревертантов на опытных
чашках превышает их количество в контоле

16.

17.

Методы молекулярной
биологии
Выделение ДНК

18.

Основной принцип
Большинство протоколов выделения ДНК состоят из двух
частей:
1) мягкий лизис клеток и солюбилизация ДНК
2) Ферментативные или химические методы удаления
загрязняющих белков, РНК или макромолекул
Базовый протокол включает 5 шагов
Лизис клеток
Удаление белков и липидов
Осаждение ДНК
Промывка
Растворение

19.

20.

Фенол/Хлороформ
• Фенол-хлороформ (~ 1: 1) добавляется к водному образцу,
содержащему необходимую ДНК, а также белки.
• Фенол и вода не смешиваются, поэтому образуются две фазы.
Фенол более плотный (хлороформ увеличивает плотность
фенола), поэтому органическая фаза опускается на дно.Две
фазы смешиваются, что приводит к денатурированию белков и
их разделению на менее полярную органическую фенольную
фазу.
• Полярная ДНК остается в полярной водной фазе, в то время как
белки остаются в менее полярной органической фазе.
• Затем водный слой можно забрать и осадить ДНК.

21.

Спин-колонки
• Принцип основан на связывании ДНК с
диоксидом кремния.
• Для лучшего связывания вносят этанол или
пропанол

22.

Оценка качества
выделенной ДНК

23.

• Наличие примесных белков (с помощью
спектрофотометра)
• Целостность молекул (с помощью
электрофореза в агарозном геле)

24.

Спектрофотометрия
• Измеряют оптическую плотность раствора ДНК при длине волны
260 нм. Нуклеиновые кислоты (НК) поглощают УФ излучение в
области 240–290 нм с максимумом при 260 нм
• Аминокислоты триптофан, тирозин и фенилаланин имеющих
максимум поглощения при 280 нм
• Для чистых образцов ДНК соотношение оптических плотностей
полученных при измерении 260 нм и 280 нм должно быть более
1,8
• По известной оптической плотности раствора можно рассчитать
концентрацию (мкг/мкл) по специальным формулам

25.

Принципы электрофореза
Электрофорез-это перенос
заряженных частиц (белки и
нуклеотиды) в буферном
растворе или в плотной среде
(подложка) под воздействием
электрического поля.
Используется для разделения
макромолекул

26.

Принципы электрофореза:
Заряд частиц
• Когда заряженные
молекулы помещаются в
электрическое поле, они
мигрируют в
направлении либо
положительного (анод),
либо отрицательного
(катод) полюса в
зависимости от их заряда.
26

27.

28.

Факторы влияющие на движение
частиц
• Заряд
• Размер
• Форма
• Материал
• Размер
пор
•Мощность
Молекулы
Напряжение
Подложка
Буфер
• pH

29.

Электрофорез белков

30.

Электрофорез в денатурирующих условиях -
SDS-PAGE электрофорез ( sodium
dodecylsulphate-polyacrylamide gel
electrophoresis)
• Белки, в отличие от ДНК, не имеют постоянного
соотношения размер:заряд
• В электрическом поле некоторые будут двигаться
к положительному, а некоторые к
отрицательному полюсу, а некоторые не будут
двигаться, потому что они нейтральны
• Заряд зависит от первичной структуры (от
аминокислотного состава)
• Подвижность также будет зависеть и от
вторичной и третичной структуры
• Используют денатурирующие условия – чтобы
разделять белки только по их размеру

31.

Додецилсульфат натрия (SDS)
• Поскольку необходимо анализировать много
разных белковых молекул различных форм и
размеров, необходимо чтобы они были
линейными без вторичной, третичной или
четвертичной структуры.
• Для этого используются детергенты (SDS).

32.

Оценка молекулярного веса по SDS-PAGE
Существует линейная связь между логарифмом молекулярного веса
полипептида и его коэффициентом RF
Коэффициент RF (хроматографическая константа) – расстояние, которое
пройдено молекулой от начала движения
Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель,
молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и
фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними

33.

Электрофорез
нуклеиновых кислот

34.

• Флуоресценция – способность переизлучать поглощенный свет
на другой длине волны
• Когда электрон переходит от возбужденного состояния к
основному, происходит потеря колебательной энергии и сдвиг
испускаемых волн в сторону большей длины
• Таким образом можно разделять возбуждающий и испускаемый
свет

35.

Детекция флуоресценции

36.

Флуоресцентный краситель DAPI
345
455

37.

489
553
651
Cy-Series
506
575
674

38.

Жизнеспособность (Live/Dead)

39.

Дифференциальное окрашивание

40.

Дифференциальное окрашивание

41.

GFP (Green Fluorescent Protein)
• Белок медузы – Aequorea victoria
• Открыт в 1960х
Img Src: http://icbxs.ethz.ch/members/leu/jellyfish.gif ,
http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/SITEGRAPHICS/Jellyfish.jpeg

42.

Nobel Prize 2008
• В 2008, трое ученых получили Нобелевскую премию за открытие
и разработку методов использования GFP

43.

Флуоресцентные белки

44.

Использование в лаборатории
•Создание репортерных
конструкций
•Оценка локализации или
экспрессии гена
Img Src:
http://www.mshri.on.ca/nagy/graphics/GFP%20mi
ce.jpg

45.

Transgenic Art

46.

Детекция ДНК в геле – с помощью красителей
Красители связываются с ДНК, поэтому
являются потенциальными мутагенами и
требуют работы в перчатках
•Бромистый этидий
(эмиссия 580 нм)
•Midori Green
(эмиссия 530 нм)

47.

Детекция ДНК в геле

48.

Электрофорез геномной ДНК
ДНК имеет очень высокую молекулярную массу и представляет собой
четкую толстую полосу. Эта пример качественного выделения.
маркеры
Геномная ДНК

49.

Электрофорез геномной ДНК
• Несмотря на то, что этот
препарат геномной ДНК не
идеален, он подходит для
использования в качестве
матрицы для последующей
ПЦР.
• A – есть примеси рРНК и др
РНК
• B – есть примеси рРНК и др
РНК
• C – хорошее выделение
• D – Много мРНК и тРНК
• E – ДНК фрагментирована, но
ПЦР может и пройти
Маркер
A B C D E

50.

Электрофорез плазмидной ДНК
Маркер
A B C D E
ДНК, рестрицированная «в линеечку»

51.

Экстракция нуклеиновых
кислот

52.

Экстракция нуклеиновых кислот
Лизис клетки
Разделение
клеточных
молекул
Осаждение НК
Получение
чистого препарата

53.

Экстракция нуклеиновых кислот
Лизирующий буфер
+
температура
Лизис клетки
Термическая
обработка
Разрушение
мембран
клеток и органелл, выход
свободных НК в раствор
Осадитель НК
Раствор
для отмывки
Разделение
клеточных
молекул
Буфер
для растворения
Осаждение НК
Получение
чистого препарата
Растворение НК
НК переходят в осадок, в
то время как другие
компоненты остаются в
растворе
Аспирация
Удаление
не
нужных
компонентов

54.

ПЦР – полимеразная
цепная реакция

55.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
изобретена в 1983 году американским
биохимиком Кэри Муллисом
В 1985 года начало использования
термостабильной
ДНК-полимеразы
Taq (Thermophilus aquaticus) и Bst
(Geobacillus stearothermophilus). Позднее
было обнаружено, что полимераза Bst
непригодна для ПЦР
В 1993 году Кэри Муллис получил за
это Нобелевскую премию по химии

56.

Polymerase Chain Reaction (PCR)
Позволяет получить множество копий
последовательности ДНК
В качестве матрицы нужны очень малые количества
ДНК
Синтезируемый фрагмент задается парой
праймеров – синтетических олигонуклеотидов
Требует термостабильную ДНК полимеразу,
дезоксирибонуклеотиды (dNTP)

57.

ПЦР
это
многократное
удвоение
определённого участка ДНК при помощи
ферментов в искусственных условиях (in
vitro).
В результате нарабатываются количества
ДНК,
достаточные
для
визуальной
детекции.
При
этом
происходит
копирование только того участка, который
удовлетворяет заданным условиям, и
только в том случае, если он присутствует
в исследуемом образце.

58.

Метод ПЦР в режиме реального
времени (qPCR) включает в себя
одновременно детекцию и количественное
определение
специфической
последовательности ДНК в образце, с
помощью оптических методов оценивают
изменение флуоресценции реакционной
смеси.
Метод
ПЦР
с
обратной
транскрипцией (RT-PCR) это когда
одноцепочечную
молекулу
РНК
превращают
в
реакции
обратной
транскрипции в комплементарную ДНК и
далее
амплифицируют
уже
одноцепочечную молекулу ДНК, используя
традиционную ПЦР.

59.

Компоненты реакции
o ДНК-матрица, содержащая тот участок
ДНК, который требуется амплифицировать;
o Два праймера, комплементарные
противоположным концам разных цепей
требуемого фрагмента ДНК;
o Термостабильная ДНК-полимераза;
o Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP)
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP);
o Ионы Mg2+, необходимые для работы
полимеразы;
o Буферный раствор, обеспечивающий
необходимые условия реакции — рН,
ионную силу раствора;
o Вода

60.

Термостабильная ДНК-полимераза
Taq-полимераза
Q5-полимераза
Rfu-полимераза
1000 п.н. в мин
2000 п.н. в мин
500 п.н. в мин
1 ошибка на 1000
1 ошибка на 280 т.п.о.
1 на 1300 т.п.о.
Обладают корректирующей
экзонуклеазной активностью от 3' до 5'

61.

Протокол ПЦР

62.

Протокол ПЦР
Денатурация
Расхождение цепей ДНК
Температура:
Тип полимеразы – Разная термостабильность
Время:
Тип полимеразы – Разная термостабильность

63.

Протокол ПЦР
Отжиг
Прикрепление праймеров к цепям ДНК
Температура:
Процент GC пар
Время:
Стандартно

64.

Протокол ПЦР
Элонгация
Синтез новой цепи ДНК полимеразой
Температура:
Стандартно
Время:
Тип полимеразы – Разная скорость работы
Длина фрагмента

65.

Протокол ПЦР
Конец цикла
Получение двух одинаковых цепей ДНК
Температура:
Время:

66.

Этапы ПЦР
25-50 циклов
Предварительная
денатурация
~950C
1-10 мин
Денатурация
~950C
10-60 сек
Отжиг
50-700C
10-60 сек
Элонгация
68-720C
10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C
7-10 мин
66