Применение метода ВЭЖХ для анализа БАД, содержащих витамин D

1.

Институт Фармации им. А.П. Нелюбина
Кафедра фармацевтической и
Москва,
токсикологической химии
2024
им А.П. Арзамасцева
Применение метода
ВЭЖХ для анализа БАД,
содержащих витамин D
Научно-исследовательская работа
студентки 5 курса, группы 705-04, Казначеевой Александры Максимовны
Научные руководители:
к. ф. н., доцент кафедры фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева,
Родионова Галина Михайловна
Научный сотрудник лаборатории Химии пищевых продуктов, к. ф. н.,
Богачук Мария Николаевна

2.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
Актуальность темы
В мире большое количество населения имеет дефицит или недостаток витамина D, который вызывает
заболевания опорно-двигательного аппарата. На рынке товары, содержащие витамин D, представлены в
виде БАД и ЛП. Не редко потребители выбирают БАД в качестве альтернативы ЛП не только для
профилактики, но и для лечения дефицита. Это объясняется их уверенностью, что БАД имеют натуральный
состав в отличие от ЛП, или же они не видят разницы между лекарствами и БАД.

3.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
Цели и задачи
Целью настоящего исследования является
количественный анализ витамина D3 методом ВЭЖХ в
БАД и сравнение показателей их состава с ЛП.
Задачи, которые необходимо решить:
– изучить фармакологию и клиническое значение витамина D
– изучить физико-химические свойства витамина D
:
;
;
– сравнить производство и государственное регулирование обращения БАД и ЛП
;
– изучить методики количественного анализа витамина D в ГФ РФ XV и зарубежных фармакопеях
– провести количественный анализ образцов БАД и ЛП методом ВЭЖХ
– оценить и сравнить результаты
– сделать выводы на основании обработанных данных

4.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
Объекты исследования
БАД
3 капсулы
с
6 таблетки
2. NOW
6. Витамин D3
2000 Витамир
3. HLS
12. Витамин
D3 500 Гроссхерц
5. NFO
13. Витрум
витамин Д3 макс
маслом
ЛП
1 водный
раствор
9. АкваD3
2 масляный
раствор
1. Доппельгерц
1 капсулы
с
4 таблетки
21. Фортедетрим
7. АкваДетрим 500
МЕ
8. АкваДетрим
10. АкваДетрим
1000 МЕ
16. Юнивит
Аква
маслом
4. ХоумЛаб
11. АкваДетрим 500
МЕ (другая партия)
14. Эвалар D3К2
20. Компливит Ca
D3 Форте
15. Nature’s Bounty
19. Витамин Д3
Реневал
Итого было отобрано: 21 образец
3 водный
раствор
18. Дэтриферол
1 масляный
раствор
17. Вигантол

5.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
Количественное определение
колекальциферола
Государственная
Фармакопея РФ ХV
European
Pharmacopoeia 11th
edition
The United States
Pharmacopeia (USP) 46
NF - 41
The Japanese
Pharmacopoeia 18th
edition
• Методика обращенофазовой ВЭЖХ с УФдетектированием, с
предварительным
омылением образцов
и экстрагированием
колекальциферола в
гексан и дальнейшим
растворением в ПФ;
расчет ведут по
внешнему стандарту.
ПФ – ацетонитрил :
метанол (20:80)
НФ –
октадецилсиликагель (C18).
• Методика
нормально-фазовой
ВЭЖХ с УФдетектированием, с
растворением
колекальциферола в
триметилпентане;
расчет ведут по
внешнему стандарту.
ПФ – пентанол :
гексан (0,3:99,7)
НФ – силикагель
Внешний стандарт
– СО
холекальциферола
CRS
• Методика
нормально-фазовой
ВЭЖХ с УФдетектированием, с
растворением
колекальциферола в
ПФ; расчет ведут по
внешнему стандарту .
ПФ – n-амиловый
спирт : гексан (3:997)
НФ – силикагель
Внешний стандарт
– СО USP
Cholecalciferol RS
• Методика
нормально-фазовой
ВЭЖХ с УФдетектированием, с
растворением в
изооктане; расчет
ведут по внутреннему
стандарту.
ПФ – n-амиловый
спирт : гексан (3:997)
НФ – силикагель
Внутренний
стандарт – раствор
диметилфталата в
изооктане (1:1000)

6.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
1. ОФС «Методы количественного определения
витаминов» ГФ РФ ХV
Жирные формы
Сущность
методики:
Омыление:
Образец + МеОН
+ КОН водноспирт. (1:9) +
гидрохинон
водяная баня t
60°С 50 мин
Экстрагирование
гексаном
объединение
вытяжек
промывка
водой до
нейтральной
реакции среды
Упаривание на
роторном
испарителе
растворение
сухого остатка в
ПФ ацетонитрил:
метанол (80:20)
Проведение расчетов:
Способ расчета по калибровочному графику,
построенный на основе анализа омыленных СО
колекальциферола (Sigma-Aldrich, США)
Методика проведения ВЭЖХ
2. Из статьи «Разработка, валидация и применение методики
количественного определения витамина D3 (холекальциферола)
методом ВЭЖХ с УФ-детектированием для анализа ЛС и БАД к пище»
(разработана при участии ПМГМУ им. И.М. Сеченова, ФГБУН ФИЦ
Питания и биотехнологии, ЦФА)
Сущность
методики:
Твердые образцы
+
Н2О
водяная
баня t 60°С 10 мин
+ метанол
Водорастворимые
формы
Экстрагирование
метанолом
Центрифугирование
(для твердых форм)
Жидкие образцы +
метанол
Для снижения рисков
потери холекальциферола Проведение расчетов:
на этапе пробоподготовки
омыление опускают и
Способ расчета по калибровочному
сразу приступают к
графику, построенного на основе
экстрагированию; ПФ в
анализа СО колекальциферола
градиентном элюировании
(Sigma-Aldrich, США)

7.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
ДЛЯ ЖИРНЫ ФОРМ
ДЛЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ФОРМ
Параметры
Значение
Подвижная фаза
Метанол-ацетонитрил (80:20)
Хроматографическая колонка
Скорость ПФ
InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x
Объем инжектируемой пробы
2, 5, 10, 20 мкл
Время удерживания
266 нм
3 мин
Значение
Ацетонитрил и 0,1% раствор
Подвижная фаза
муравьиной кислоты (70:30) в
градиентном элюировании (по
статье)
0,8 мл/мин
40⸰С
(диодно-матричный детектор)
Параметры
50 mm, 2.7 µm
Температура колонки
Длина волны детектирования
Условия проведения анализа
Хроматографическая колонка
InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x
50 mm, 2.7 µm
Скорость ПФ
0,9 мл/мин
Температура колонки
40⸰С
Объем инжектируемой пробы
2, 5, 10, 20 мкл
Длина волны детектирования
(диодно-матричный детектор)
Время удерживания
266 нм
8,35 мин

8.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
Проведение расчетов
КАЛИБРОВОЧНАЯ КРИВАЯ АНАЛИТИЧЕСКОЙ
ОБЛАСТИ ДЛЯ ЖИРНЫХ ФОРМ
КАЛИБРОВОЧНАЯ КРИВАЯ АНАЛИТИЧЕСКОЙ
ОБЛАСТИ ДЛЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ФОРМ
V ita m in D 3 o m il, D A D 1 D
A re a = 2 .6 8 9 5 4 2 9 5 *A m t -1 8 .0 9 4 2 0 9
A re a
V ita m in D 3 , D A D 1 D
A re a = 2 .9 6 4 1 9 7 6 6 *A m t + 7 .6 7 3 0 0 5 3
A re a
2500
R e l. R e s % (3 ): 1 7 .5 9 2
5000
R e l. R e s % (1 ): -3 3 .9 6 9
10
8
2000
4000
1500
6
3000
4
8
9
6
1000
2000
9
1000
3 1
5
3 45
2
74
12
0
C o rre la tio n : 0 .9 9 9 9 3
0
7
500
500
1000
1500
A m o u n t[n g]
10
0
C o rre la tio n : 0 .9 9 9 9 0
0
200
400
600
A m o u n t[n g]

9.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
Результаты анализа
В ГФ XV РФ отсутствует норма содержания витамина D в
образцах, в связи с этим были выбраны границы нормы
содержания из EP 11 ed для порошков и жирных форм – 90-110%
БАД
5 таблетки
6. Витамин D3 2000
Витамир
12. Витамин D3 500
Гроссхерц
13. Витрум витамин
Д3 макс
1
ЛП
масляный
раствор
4. ХоумЛаб
1 капсулы с
маслом
5.NFO
1 капсулы с
маслом
21. Фортедетрим
Для БАД также оценивался верхний допустимый уровень
суточного потребления* холекальциферола, так как для них этот
параметр регламентирован (Решение Комиссии Таможенного
союза ЕврАзЭС от 07.04.2011 N 622 «О внесении изменений в
единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические
требования к товарам, подлежащим санитарноэпидемиологическому надзору (контролю)»)
Верхний допустимый уровень составляет 15 мкг/сут
2 таблетки
7. АкваДетрим 500
МЕ
11. АкваДетрим
500 МЕ (др.
партия)
Образец БАД
Уровень
превышения
суточного
потребления
3. HLS
превышение на
3,33%
4. ХоумЛаб
50 мкг на каплю
5. NFO
14. Эвалар Д3 К2
50 мкг на
капcулу
превышение на
5,07%
14. Эвалар D3К2
19. Витамин Д3
Реневал
*Учитывались рекомендации по применению в инструкции, например,
принимать 1/4 таблетки в сутки, что уже не будет превышением
суточного потребления; поделить капсулу не представляется возможным

10.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
Выводы
Среди 8 образцов ЛП два (Аквадетрим 500МЕ таб, Фортедетрим) не соответствуют выбранным
в этом исследовании параметрам качества по содержанию витамина D3.
Среди 12 образцов БАД (D3 Витамир, D3 Реневал, D3 Гроссхерц, Витрум D3 макс, Эвалар,
ХоумЛаб, NFO) семь не соответствуют выбранным параметрам качества.
Четыре образца БАД (NFO, HLS, Эвалар, ХоумЛаб) превышают верхний допустимый уровень
потребления холекальциферола в сутки, согласно единым требованиям комиссии ЕврАзЭС.
В ходе анализа данных, корреляции в качестве между БАД зарубежного производства и
отечественного выявлено не было.
По результатам проведенного исследования, утверждать, что БАД имеют аналогичное лекарствам
качество, нельзя. Требуется совершенствование и ужесточение стандартов, нормирующие
процессы производства, унифицирование классификации БАД на международном уровне.

11.

12.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
Результаты анализа
Для БАД оценивался верхний допустимый уровень суточного потребления*
холекальциферола, так как для них этот параметр регламентирован
(Решение Комиссии Таможенного союза ЕврАзЭС от 07.04.2011 N 622 «О
внесении изменений в единые санитарно-эпидемиологические и
гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарноэпидемиологическому надзору (контролю)»)
Образец БАД
Уровень
превышения
суточного
потребления
3. HLS
превышение на
3,33%
4. ХоумЛаб
50 мкг на каплю
5. NFO
50 мкг на капcулу
14. Эвалар Д3 К2
превышение на
5,07%
Верхний допустимый уровень составляет 15 мкг/сут
*Учитывались рекомендации по применению в инструкции,
например, принимать 1/4 таблетки в сутки, что уже не будет
превышением суточного потребления; поделить капсулу не
представляется возможным

13.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
Методика проведения ВЭЖХ для
жирных образцов
1. ОФС «Методы количественного определения витаминов» ГФ РФ ХV
Сущность
методики:
Омыление:
Образец + КОН водно-спирт.
(1:9) + гидрохинон
водяная баня t 60°С 50 мин
Экстрагирование гексаном
объединение вытяжек
промывка водой до
нейтральной реакции среды
Проведение расчетов:
Способ расчета по калибровочному графику, построенный на
основе анализа омыленных СО колекальциферола (SigmaAldrich, США)
Упаривание на роторном
испарителе
растворение сухого остатка
в ПФ ацетонитрил: метанол
(80:20)

14.

Институт Фармации
им. А.П. Нелюбина
Применение метода ВЭЖХ для
анализа БАД, содержащих витамин D
Методика проведения ВЭЖХ для
водорастворимых форм
2. Из статьи «Разработка, валидация и применение методики количественного определения витамина D3
(холекальциферола) методом ВЭЖХ с УФ-детектированием для анализа лекарственных средств и биологически активных
добавок к пище» (разработана при участии ПМГМУ им. И.М. Сеченова, ФГБУН ФИЦ Питания и биотехнологии, ЦФА)
Сущность методики:
Для снижения рисков
потери холекальциферола
на этапе пробоподготовки
омыление опускают и сразу
приступают к
экстрагированию; ПФ в
градиентном элюировании
Твердые образцы + Н2О
водяная баня t 60°С 10
мин
+ метанол
Экстрагирование
метанолом
Жидкие образцы +
метанол
Проведение расчетов:
Способ расчета по калибровочному графику, построенного на основе анализа СО
колекальциферола (Sigma-Aldrich, США)
Центрифугирование
(для твердых форм)

English Русский Rules