Методы выделения и количественного определения основных БАВ лекарственного сырья

1. Методы выделения и количественного определения основных БАВ лекарственного сырья

Курс «Инновационные технологии в
лекарственном растениеводстве»
Проф. Е.Л. Маланкина

2. План

Методы выделения БАВ
Методы определения БАВ

3. Современные методы анализа

ВЭЖХ
ГХ
Спектрофотометрия
ЯМР

4. Классификация по агрегатному составу фаз

классификация основана на различиях в
агрегатных состояниях применяемых в
хроматографии подвижных и неподвижных
фаз. В данной классификации все виды
подразделяются на 3 основных вида по
агрегатному состоянию используемой подвижной
фазы:
газовая (ГХ, GH),
жидкостная (ЖХ, LH)
сверхкритическая флюидная хроматография
(подвижная фаза - полярный газ (СО2, NH3 и т.д.)
сжатый до жидкого состояния) - что совершенно
естественно, т.к. именно подвижная фаза
растворяя в себе пробу определяет спектр
разделяемых и анализируемых веществ.

5.

6. Тонкослойная хроматография Thin-Layer Chromatography

является
планарной
разновидностью
жидкостной
хроматографии, в
которой подвижная
фаза (ПФ) движется
в пористой среде
слоя адсорбента.
Хроматограмма чернил

7. Принцип

основанный на различии в скорости
перемещения компонентов смеси в
плоском тонком слое (толщина 0,1-0,5
мм) сорбента при их движении в
потоке подвижной фазы (элюента).
Последняя представляет собой, как
правило, жидкость, однако
осуществлен и газовый вариант ТСХ.

8. Тонкослойная хроматография

преимуществом
является большая
скорость анализа,
более высокое
качество разделения,
чем у бумажной
хроматографии,
возможность выбора
одной из неподвижных
фаз, обладающих
наиболее
подходящими
свойствами.

9. История

Измаилов Н.А и Шрайбер М.С. , русские
химики, провели в 1938 году
хроматографическое исследование на
плоской горизонтальной пластинке, на
которую нанесли раствор.
Но активный интерес возник в 50-х годах.
Появились различные сорбенты, понятие о
системах растворителей.

10. Необходимые материалы для ТСХ

Для разделения используются пластины.
В качестве сорбентов используют
мелкозернистые силикагель, Аl2О3,
целлюлозу, крахмал, полиамид,
иониты и др. Суспензиями этих
сорбентов покрывают пластинки из
стекла, фольги или пластика;
для закрепления слоя применяют
крахмал, гипс или др. связующие.
Промышленность выпускает готовые
пластинки с уже закрепленным слоем
сорбента.

11. Необходимые материалы для ТСХ

Оксид алюминия и силикагель, как правило,
размещается на стеклянной,
металлической или пластиковой основе. В
ряде случаев к сорбенту добавляется
флуоресцентный индикатор синего или
зелёного цвета.
Также существуют NH2-, CN-, ДИОЛ, и RP
модифицированные сорбенты для анализа
веществ не разделяющихся на силикагелях
напрямую.
Разделение, как правило, производится в
специальных герметичных камерах для
ТСХ.

12. Необходимые материалы для ТСХ

Элюентами служат обычно смеси
органических растворителей, водных
растворов кислот, солей,
комплексообразующих и др. в-в.

13. Процессы при хроматографии

В зависимости от выбора
хроматографической системы (состава
подвижной и неподвижной фаз) в
разделении веществ основную роль могут
играть процессы адсорбции, экстракции,
ионного обмена, комплексообразования.
На практике часто реализуются
одновременно несколько механизмов
разделения.

14. Процесс ТСХ

15. Схема ТСХ

16. Развитие процесса хроматографирования во времени:

Развитие процесса
хроматографировани
я во времени:

17. Развитие процесса хроматографирования во времени:

18. Хромато-грамма 10 ЭМ проявлена ванилином

Хроматограмма 10
ЭМ
проявлена
ванилином

19. В зависимости от положения пластинки и направления потока элюента различают

Восходящую ТСХ
Нисходящую ТСХ
Горизонтальную ТСХ

20. Области применения

для разделения и анализа как органических, так и
неорганических веществ:
в т. ч. близких по свойствам ионов благородных
металлов, а также полимеров, лек. средств,
пестицидов, аминокислот, липидов, алкалоидов и т.
д.
С помощью ТСХ удобно анализировать
микрообъекты (малые количества веществ),
оценивать чистоту препаратов, контролировать
технологические процессы и состав сточных вод,
изучать поведение различных ионных форм
элементов, предварительно подбирать условия
для колоночной хроматографии.

21. Колоночная хроматография

Классический
пример
лабораторное
разделение
хлорофилла и
каротиноидов

22. Газовая хроматография

разновидность хроматографии - метод разделения летучих
компонентов, при котором подвижной фазой служит инертный
газ (газ-носитель), протекающий через неподвижную фазу с
большой поверхностью. В качестве подвижной фазы
используют водород, гелий, азот, аргон, углекислый газ. Газноситель не реагирует с неподвижной фазой и разделяемыми
веществами.
Различают газо-твёрдофазную и газо-жидкостную
хроматографию. В первом случае неподвижной фазой
является твёрдый носитель (силикагель, уголь, оксид
алюминия), во втором — жидкость, нанесённая на
поверхность инертного носителя.
Разделение основано на различиях в летучести и
растворимости (или адсорбируемости) компонентов
разделяемой смеси.

23. Схема хроматографа

Схема газового хроматографа 1 — источник газа-носителя (подвижной фазы)
2 — регулятор расхода газа носителя
3 — устройство ввода пробы
4 — хроматографическая колонка в термостате
5 — детектор
6 — электронный усилитель
7 — регистрирующий прибор (самописец, компьютер)
8 — расходомер

24. Устройство хроматографа

25. Хроматограф

26. Хроматограф

27. Хроматограф

Регулятор расхода газа
Предназначение этого компонента газового хроматографа —
контроль расхода газа в системе, а также поддержка необходимого
давления газа на входе в систему. Обычно в качестве регулятора
расхода газа используются редуктор или дроссель.
Устройство ввода пробы
Предназначено для подачи пробы анализируемой смеси в
хроматографическую колонку.
В том случае, если хроматограф предназначен для анализа жидких
проб, устройство ввода проб совмещается с испарителем.
Проба вводится в испаритель при помощи микрошприца путём
прокалывания эластичной прокладки. Испаритель обычно нагрет до
температуры, превышающей температуру самой колонки на 50 °C.
Объём вводимой пробы — несколько микролитров

28. Хроматограф

Хроматографические колонки
Под колонкой подразумевается сосуд, длина которого значительно
больше диаметра. Для газовой хроматографии обычно используют
U-образные или спиральные колонки. Внутренний диаметр колонок
— 2-15 мм, а длина — 1-20 м. Материалом для изготовления
колонок служит стекло, нержавеющая сталь, медь, иногда
фторопласт. В последнее время наибольшее распространение
получили капиллярные колонки изготовленные из плавленного
кварца, с нанесенной внутри неподвижной фазой. Длина подобных
колонок может достигать сотен и даже тысяч метров, хотя чаще
используются колонки длиной 30-50 м.
Крайне важно плотное наполнение колонок неподвижной фазой, а
также обеспечение постоянства температуры колонки в течение
всего процесса хроматографирования. Точность поддержания
температуры должна составлять 0,05-1 °C. Для точного
регулирования и поддержания температуры используют термостаты.

29. Хроматограф

Детекторы
Детекторы предназначены для непрерывного измерения
концентрации веществ на выходе из хроматографической колонки.
Принцип действия детектора должен быть основан на измерении
такого свойства аналитического компонента, которым не обладает
подвижная фаза.
В газовой хроматографии используют следующие виды детекторов:
пламенно-ионизационный детектор
детектор по теплопроводности (катарометр)
детектор электронного захвата
пламенно-фотометрический детектор
термоионный детектор
фотоионизационный детектор
масс-спектрометр
ИК-фурье спектрометр

30. ВЭЖХ - High-performance liquid chromatography (HPLC )

31. Принцип

Принцип жидкостной хроматографии
состоит в разделении компонентов
смеси, основанном на различии в
равновесном распределении их между
двумя несмешивающимися фазами,
одна из которых неподвижна, а другая
подвижна (элюент).

32. ТИПЫ ВЭЖХ

По механизму разделения
анализируемых или разделяемых
веществ ВЭЖХ делится на
адсорбционную, распределительную,
ионообменную, эксклюзионную,
лигандообменную и другие.

33. Хроматограмма

Пики отдельных веществ

34. Области применения

Метод ВЭЖХ находит широкое применение
в таких областях, как химия, нефтехимия,
биология, биотехнология, медицина,
пищевая промышленность, охрана
окружающей среды, производство
лекарственных препаратов и во многих
других.
Определение остаточных пестицидов.
Флавоноидов, витаминов, алкалоидов и др

35. Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография позволяет разделять ионы и полярные
молекулы на основании зарядов разделяемых молекул.
Данный вид хроматографии позволяет разделить практически любые
заряженные молекулы, в том числе: крупные — белки, малые—молекулы
нуклеотидов и аминокислот. Часто ионообменную хроматографию
используют как первый этап очистки белков.
Для проведения ионообменной хроматографии применяют синтетические
полимеры, чаще всего на основе полистирола и полифенолов.
Выпускаемые промышленностью ионообменные смолы имеют вид
небольших полимерных шариков, которые перед использованием нужно
замачивать в воде или другом элюенте.
Набухание ионообменной смолы сопровождается увеличением доступности
функциональных групп полимера за счет раздвигания макромолекул
молекулами элюента, как при пластификации полимера. Степень набухания
ионообменной смолы регулируют как длиной макромолекул, так и степенью
поперечной сшивки полимерной матрицы.

36.

37. Хромато-масс

Масс-спектрометрия (масс-спектроскопия,
масс-спектрография, масс-спектральный
анализ, масс-спектрометрический
анализ) — метод исследования вещества,
основанный на определении отношения
массы к заряду ионов, образующихся при
ионизации представляющих интерес
компонентов пробы. Один из мощнейших
способов качественной идентификации
веществ, допускающий также и
количественное определение.

38. Масс-анализаторы

Полученные при ионизации ионы с помощью электрического поля
переносятся в масс-анализатор. Там начинается второй этап массспектрометрического анализа — сортировка ионов по массам (точнее по
отношению массы к заряду, или m/z). Существуют следующие типы массанализаторов:
непрерывные масс-анализаторы
Магнитный и электростатический секторный масс-анализатор (англ. Sector
instrument)
Квадрупольный масс-анализатор (англ. Quadrupole mass analyzer)
импульсные масс-анализаторы
Времяпролётный масс-анализатор (англ. Time-of-flight mass spectrometry)
Ионная ловушка (англ. Ion trap)
Квадрупольная линейная ловушка (англ. Quadrupole ion trap)
Масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием
(англ. Fourier transform ion cyclotron resonance)
Орбитрэп (англ. Orbitrap)