Микробиологическая диагностика туберкулёзной инфекции

1. ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Минздрава РФ

Кафедра туберкулеза
Микробиологическая
диагностика туберкулезной
инфекции
Б.С. Кибрик
Председатель ЦКМС
Профессор А.Н. Шкребко
Протокол №
2014

2. Для установления диагноза туберкулеза, дифференциальной диагностики и назначения рациональных схем лечения в лаборатории

противотуберкулезного
диспансера применяется следующая
диагностическая схема:
1. выявление возбудителя;
2. дифференциация МБТ и
нетуберкулезных микобактерий;
3. определение лекарственной
чувствительности возбудителя.

3.

А. Метод окраски по Цилю-Нильсону.
Б. Метод люминисцентной микроскопии.
В. Эпителиоидные клетки из которых развиваются клетки Лангханса
Г. Клетки Лангханса- защитная реакция организма на внедрение МБТ
Д.Посев

4. 1. Выявление микобактерий

Выявление микобактерий, основанные
на особенностях возбудителя:
особенности строения клеточной
стенки, ростовые характеристики.
Молекулярно-генетические методы,
позволяющие выявить возбудителя по
наличию в структуре ДНК
видоспецифических
последовательностей.

5. I. ВОЗБУДИТЕЛЬ ТУБЕРКУЛЕЗА

1.1. Некоторые особенности
популяции МБТ:
Внутриклеточная локализация;
Способность перехода в «дремлющее»
(дормантное) состояние и возможность
реактивации в отдаленные сроки;
Присутствие в популяции МБТ особей с ЛУ к
противотуберкулезным препаратам
Проблема ЛУ изучается многие 10-летия.Мне
она известна с конца 50 годов

6. ВОЗБУДИТЕЛИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Класс: Schizomycetes
Порядок: Actinomicetalis
Семейство: Mycobacteriaceae
Род: Mycobacterium
(включает более 140 видов)
M.tuberculosis complex
M.tuberculosis humanus
M.tuberculosis bovis (в том числе M.bovis-BCG)
M.tuberculosis africanum
M.tuberculosis microti
M.tuberculosis canetti
M. caprae
M. pinnipedii

7.

ВОЗБУДИТЕЛИ ТУБЕРКУЛЕЗА
Грам-положительные
микроорганизмы
Грам-отрицательные
микроорганизмы
Липидный бислой клеточной
мембраны большинства Грам+
микроорганизмов покрыт
пористым пептидогликановым
слоем, который не вполне
защищает от антимикробных
агентов
Имеют две мембраны. Внешняя
мембрана функционирует как
эффективный барьер
проницаемости, так как состоит
из липополисахаридов (ЛПС) и
транспортных каналов.
липидный бислой;
пептидогликан;
арабиногалактан
Микобактерии
Микобактерии продуцируют
многослойную толстую
клеточную оболочку, богатую
миколовыми кислотами и
исключительно эффективно
выполняющую барьерные
функции.
липиды вместе с ЛПС;
миколаты
канал
ы
глицериды
липоарабиноманнан

8. Известно более ста видов микобактерий туберкулёза

МБТ эволюционно молодые образования.
Наиболее важными и малоизученными сегодня
являются штаммы МБТ относящиеся к семейству
Beijing.
Установлены микроэпидемии туберкулёза,
вызванные этим штаммом (впервые в Южной
Африке, Китае, а в последнее время и в России).
Характерны более выраженные формы туберкулёза.

9. 2. Методы выявления МБТ:

Световая микроскопия (по Циль-
Нильсену)
Люминисцентная микроскопия – на
10% чувствительнее чем по Ц.Нильсену
Светодиодная люминисцентная
микроскопия. Обычные микроскопы с
LED приставкой. Работают на
аккумуляторных батареях.

10. Выявление МБТ микробиологическими методами

Микроскопическое исследование МБТ
отличается от других микроорганизмов
сложной стенкой, содержащей липиды,
которые несмотря на обесцвечивание
содержащими кислоту реагентами,
удерживают биохимические красители –
«кислотоустойчивость».
Этот метод используется:
- на первичных этапах исследования;
- при диагностическом наблюдении.

11. Недостатки метода выявления МБТ

низкая чувствительность. Для
получения положительного результата
необходимо около 5000 МБТ клеток в
миллилитре мокроты.

12. Ограничения метода:

метод позволяет говорить о наличии
или отсутствии в препарате
кислотоустойчивых бактерий;
нельзя отличить живые клетки от
неживых;
нельзя дифференцировать МБТ от
нетуберкулезных возбудителей –
микобактериозов.

13. Культуральные методы диагностики

Метод посева диагностического
материала на питательные среды.
Чувствительность – позволяет выявить
МБТ при наличии в 1 мл материала
нескольких десятков жизнеспособных
особей.

14. Достоинства:

точная диагностика;
позволяет выделить культуру
возбудителя, необходимую для
определения ее видовой
принадлежности и определения
спектра лекарственной
чувствительности.

15. Недостатки:

медленный рост МБТ требует
длительного ожидания результатов
(14 дней – 12 недель).

16. Ограничения:

перед посевом образцы должны быть
деконтаминированы для
предотвращения роста других
микроорганизмов. В какой-то этот
процесс действует на МБТ.

17. Культивирование на плотных питательных средах Для уверенности в выводах используются две разные питательные среды:

Левенштейна-Йенсена и Финна-II.
Культивирование на жидких средах
- повышает выявляемость на 10% по
сравнению с плотными средами;
-использование системы ВАСТЕС,
которая позволяет ускорить получение
результатов по сравнению с посевом на
плотные питательные среды на дни и
недели.

18. Выявление МБТ молекулярно-генетическими методами:

Выявление МБТ молекулярногенетическими методами:
Использование тест-системы для
выявления ДНК МБТ методом
полимеразной цепной реакции(ПЦР);
Получение положительного результата
методом ПЦР позволяет в течение 1-2
дней установить наличие МБТ в
диагностическом материале.

19. Видовая идентификация возбудителя :

Для дифференциации МБТ от
нетуберкулезных микобактерий.
Идентификация по культуральным
свойствам на плотных питательных
средах.
- Рост в течение 7-10 дней может
свидетельствовать о выделении
быстрорастущих нетуберкулезных
микобактерий (НТМ).
- Рост через 3-4 недели в пользу
патогенных штаммов МБТ.

20. Видовая идентификация

Идентификация в системе ВАСТЕК.
При получении роста МБТ обязательна
микроскопия.
Молекулярные методы
идентификации, основанные на ПЦР.
Основаны на видоспецифических
структурах в геноме возбудителя.

21.

П.Е.Фармер, А.С.Кононец,
С.Е.Борисов, А.Гольдфарб,
Б.Н.Крисверт, Т.Хилинг, Н.Мак-Ки
Полирезистентный туберкулез:
угроза человечеству, Гарвардская
медицинская школа, Институт
«Открытое общество», стр.36, 1999.

22. ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ % Частота лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулёзным препаратам у впервые выявленных

больных критерием включения в когорту было наличие МБТ,факт
определения ЛУ и ее наличие хотя бы у 1 больного
80
58
56
39
20
20
5
4
3

23. Определение лекарственной чувствительности

Метод культивирования МБТ в
присутствии противотуберкулезных
препаратов.
- Наличие роста культуры указывает на
лекарственную устойчивость.
- Ингибирование роста указывает на
лекарственную чувствительность.
Генетические методы – выявление
специфических альтераций в геноме с
резистентностью к определяемым
препаратам.

24. Определение ЛЧ к препаратам первого ряда.

Устойчивость к рифампицину и
изониазиду является индикатором
МЛУ.

25. Определение ЛЧ к препаратам второго ряда

26. Фенотипические методы:

Прямое определение ЛЧ МБТ. На плотную
питательную среду высевается
непосредственно мокрота от больного с
высоким риском на наличие МЛУ ТБ.
Непрямое определение ЛЧ МБТ – «золотой
стандарт» проводится выделение чистой
культуры МБТ из клинических образцов.
Затем на яичные или плотные агаровые
среды, содержащие лекарственные
препараты. Определение ЛЧ методом
абсолютных концентраций на среде
Левенштейно-Йенсена, а также на жидких
средах в системе ВАСТЕС.

27. Генетические методы – 4 варианта

Биологические микрочипы
2. ПЦР в режиме реального времени
3. ДНК –стриловая технология
4. «Картриджная» технология (набор
G.Xpert MTB/RIF).
1.