Хромосомный микроматричный анализ

1.

ХРОМОСОМНЫЙ МИКРОМАТРИЧНЫЙ
АНАЛИЗ
И.В. Канивец

2. СИНДРОМ - ?

• ВПС
• Особенности фенотипа
• Аномалии соединительной
ткани
• Задержка развития
• Особенности характера и
поведения
• Задержка роста
• Эндокринные нарушения

3. СИНДРОМ - ?

• Неонатальная гипотония
• Нормальный или ускоренный • Нормальная окружность
рост
головы
• Тяжелая задержка развития • Множественные МАР

4.

1 970,0
млн USD
469,2
млн
USD

5.

dup 17p11.2
del 1p36
del 9q34.3
del 3q29 1 970,0
млн USD
469,2
млн
USD
del 22q13.3
dup7q11.23
del 15q24
dup 22q11.2

6. ХРОМОСОМНАЯ ПАТОЛОГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

• Хромосомная патология – любое
нарушение числа и/или структуры
хромосом

7. ХРОМОСОМНАЯ ПАТОЛОГИЯ КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

• числовые и структурные
аномалии хромосом (за
исключением
сбалансированных)
патогенны
• характеризуются
мультисистемным
поражением
• являются причиной
задержки
развития/умственной
отсталости
• часто является причиной
потери беременности
• многие микроделеционные
синдромы не имеют четкого
фенотипа и часто остаются
недиагностированными
• не могут быть вылечены
• могут возникать повторно при
следующих беременностях
• являются показанием для
консультации врача-генетика

8.

ЭВОЛЮЦИЯ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
1888
1923
1947
1956
1970s
Был предложен
термин
«хромосома»
48 хромосом
у человека
1986
2004
2002
2010
2012
FISH
Термин
«кариотип»
впервые появился
в Pubmed
Установлено
количество
хромосом у
человека
Разработаны
методы окраски
хромосом
BAC array
CGH
Oligo array CGH
и
SNP хромосомный
микроматричный
анализ
Хромосомный
микроматричный
анализ
зарегистрирован в
России как
медицинский тест
ACMG & ISCA
рекомендуют
заменить
кариотипирование
хромосомным
микроматричным
анализом

9. НА ПУТИ К МОЛЕКУЛЯРНОМУ КАРИОТИПИРОВАНИЮ

10. НА ПУТИ К МОЛЕКУЛЯРНОМУ КАРИОТИПИРОВАНИЮ

11. КАК ВЫЯВИТЬ ВСЕ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ CNV?

Вид анализа
Анализ выявляет
Достоинства
Недостатки
Анеуплоидии, очень
большие делеции и
дупликации,
сбалансированные
транслокации
Способен выявлять
сбалансированные
перестройки
• Низкое разрешение (не
выявляет перестройки менее
8 Mb)
• Не выявляет
низкоуровневый мозаицизм
• Субъективный
• Длительный
FISH
Анеуплоидии,
делеции/дупликации,
низкоуровневый
мозаицизм
Способен подтверждать
носительство
сбалансированных
транслокаций
• Возможно исследование
только заранее определенной
области генома
• Требуется клиническая
предпосылка
• Высокая стоимость
Хромосомный
микроматричный
анализ
Анеуплоидии,
большие делеции/
дупликации, CNV до
1000 п.н. в таргетных
регионах*, AOH, UPD
Полногеномный,
высокое разрешение,
объективный, точный,
быстрый
Не определяет мутации,
сбалансированные
транслокации, болезни
экспансии.
Анализ кариотипа

12.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ
• Хромосомный микроматричный анализ –
молекулярно-цитогенетический метод анализа
вариаций числа копий ДНК по сравнению с
набором проб или маркеров, покрывающих
определенный набор генов или весь геном,
без необходимости культивирования клеток
• Синонимы: молекулярное кариотипирование,
сравнительная геномная гибридизация на
чипах, молекулярно-цитогенетическое
исследование

13.

ИСТОРИЯ
1989
Первый прототип микроматицы на микроскопном стекле
1993
Создание микроматрицы с общей последовательностью проб >1 млн. нуклеотидов
1995
Первая опубликованная научная работа с использованием микроматриц (Shena et al.)
1996
Промышленный выпуск микроматриц (Affymetrix)
1997
Полногеномный экспрессионный анализ S. cerevisiae (De Risi et al.)
1999
Молекулярная классификация опухоли и использованием микроматриц (Goluet al.)
2000
Молекулярный фенотип опухли (Pat Brown et Al.)
2003
Производители микроматриц Affymrtrix, Illumina, Agilent, Nimblegen (Roche) и мн. др.
2004
Полногеномный анализ на одной микроматрице (Affymetrix)
2005
Первая микроматрица одобренная FDA (Amplichip, Roche)
2008
Широкое использование разных типов микроматриц – SNP, CNV, Expression, ChIP, Tilling и пр.
2011
>100,000 исследований с использованием микроматриц в молекулярной цитогенетике.
2012
Выявление причин ВПР и ЗПМР в 20-25% случаев.

14. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ГЕНОМНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ

15. ХРОМОСОМНЫЙ МИКРОМАТРИЧНЫЙ АНАЛИЗ

16.

АНАЛИЗ СИГНАЛА ОТ SNP
Each point represent a single SNP interrogated by A or B alleles probes and
assigned an arbitrary fluorescence uni of haploid locus (single allele) =0,5
A-B=?
Normal 2N
AA:(0.5+0.5)=+1
AB: 0.5-0.5 = 0
BB: 0-(0.5+0.5)=-1
AA
AB
BB
Loss 1N
A:0.5-0 =+0.5
B:0-0.5=-0.5
A
B
Gain 3N
AAA:(0.5+0.5+0.5)=+1.5
AAB: (0.5-0.5 )-0.5 = +0,5
ABB: 0.5-(0.5+0.5)=-0.5
BBB: 0-(0.5+0.5+0,5)=-1.5
Mosaic gain
AAA
AAB
ABB
BBB
Mosaic loss
Loss of
heterozigosity

17. CGH или ХМА?

18.

Распределение проб на микроматрицах разной плотности
Клиническая достоверность
Микроматрица 400К – 90%
Микроматрица 2,67М – 99,6%

19.

МИКРОМАТРИЦЫ ВЫСОКОЙ, СРЕДНЕЙ И
НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ
2,7
млн
750
тыс
180
тыс

20. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗРЕШАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ МИКРОМАТРИЦ

Размер определяемых микроделеций и микродупликаций зависит от
параметров маркерных сигналов на микроматрице
1. Волнистость (Waviness SD)
глобальная мера распределения зондов, которая нечувствительна
к вариациям распределения на коротких расстояниях и сфокусирована
на больших расстояниях
2. Различие в интенсивности сигнала между двумя соседними
маркерами (MAPD - Median of the Absolute values of all Pairwise Differences)
При Волнистости <=0,12 и MAPD <=0,25 точность определения CNVs
99,5% достигается при включении в анализ 20 маркеров для делеций и
50 маркеров для дупликаций.
Для генов, рекомендованных ISCA плотность маркеров составляет 1
маркер на 384 нуклеотида
Таким образом, теоретически возможная минимальная разрешающая
способность ХМА составляет 7680 для делеций и 19200 для дупликаций

21. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗРЕШАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ МИКРОМАТРИЦЫ В ХОДЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

Гетерозиготная делеция
31 экзона гена EP300,
размер 1297 п.н.
Область отсутствия
гетерозиготности
Отсутствие маркеров в области
интрона

22.

Пациент Л.
Клиническая картина: Задержка развития, фенотип синдрома Рубинштейна-Тейби
Молекулярный кариотип: arr[hg19] 16p13.3(3828749_3833104)x1 Размер 4355 пн.
Обнаружена делеция двух экзонов гена CREBBP, ассоциированного с синдромом РубинштейнаТейби

23.

КАКОЕ РАЗРЕШЕНИЕ ВЫБРАТЬ?
CytoScan HD
Область
применения
Постнатальная
(врожденные пороки
развития, умственная
отсталость, аутизм),
пренатальная
диагностика (УЗИ
маркеры ХП, пороки
развития плода).
Диагностика
экспертного уровня
CytoScan 750k
Постнатальная
(врожденные пороки
развития, умственная
отсталость, аутизм),
пренатальная
диагностика (УЗИ
маркеры ХП, пороки
развития плода).
Рутинная диагностика.
Замена анализа
кариотипа и FISH
CytoScan Optima
Альтернатива BoBs
для пренатальной
диагностики
Исследование
абортивного
материала
Материал для
исследования
Кровь (венозная и капиллярная), ворсины хориона, амниотическая жидкость,
пуповинная кровь, паренхиматозные органы плода
Аналитические
характеристики
Число маркеров – 2,76
млн.
del/dup – от 25 kb
LOH – от 3 Mb
Мозаицизм – от 15%
Число маркеров – 750
тыс.
del/dup – от 200 kb
LOH – от 5 Mb
Мозаицизм – от 20%
Число маркеров – 180
тыс.
del/dup – от 800 kb
LOH – от 5 Mb
Мозаицизм – от 20%

24.

ЭТАПЫ ХРОМОСОМНОГО МИКРОМАТРИЧНОГО
АНАЛИЗА
1
DNA extraction
Digestion
Ligation
PCR
amplification
2
QC control 1
Purification
Quantitation
Fragmentation
3
QC control 2
Labelling
Hybridization
4
Scanning
Data processing
Data analysis
Washing and
staining
Report
46 пипетирований, 10 стадий и 2,5 дня от образца до результата

25. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ХМА

26. ВАРИАЦИИ ЧИСЛА КОПИЙ ДНК (CNV)

• Вариация числа копий (CNV) – это изменение
числа копий определенного сегмента ДНК
размером, по крайней мере, 1000 п.н., по
сравнению с репрезентативным референсным
геномом.
• Термин «CNV» не подразумевает исходно
обязательной клинической значимости, поэтому
CNVs классифицируются на патогенные,
непатогенные и CNVs с неизвестной значимостью.

27.

Частота (%)
СРЕДНЕЕ КОЛИЧЕСТВО CNV У ЧЕЛОВЕКА

28.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЛИНИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ
(КАУЗАТИВНОСТИ) CNVs
Базы данных OMIM, ISCA, DECIPHER, GeneReviews, литературные данные -PubMed

29.

ЧТО ОПРЕДЕЛЯЕТ КЛИНИЧЕСКУЮ ЗНАЧИМОСТЬ CNV?
Включена ли CNV в базы данных нормальных вариаций?
Содержит ли CNV область, делеция или дупликация
которой является причиной известного синдрома?
Содержит ли CNV ген, делеция или дупликация которого
являются причиной известных синдромов?
Каков общий генный контент или размер CNV?
Является ли обнаруженная CNV вариацией de novo?
Является ли CNV наследуемой?

30.

ЧТО ОПРЕДЕЛЯЕТ КЛИНИЧЕСКУЮ ЗНАЧИМОСТЬ CNV?
Включена ли CNV в базы данных нормальных
вариаций?
Содержит ли CNV область, делеция или дупликация
которой является причиной известного синдрома?
Содержит ли CNV ген, делеция или дупликация которого
являются причиной известных синдромов?
Каков общий генный контент или размер CNV?
Является ли обнаруженная CNV вариацией de novo?
Является ли CNV наследуемой?

31. ПОПУЛЯЦИОННЫЕ БАЗЫ ДАННЫХ CNVs

http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home

32.

ЧТО ОПРЕДЕЛЯЕТ КЛИНИЧЕСКУЮ ЗНАЧИМОСТЬ CNV?
• Включена ли CNV в базы данных нормальных вариаций?
• Содержит ли CNV область, делеция или дупликация
которой является причиной известного синдрома?
• Содержит ли CNV ген, делеция или дупликация которого
являются причиной известных синдромов?
• Каков общий генный контент или размер CNV?
• Является ли обнаруженная CNV вариацией de novo?
• Является ли CNV наследуемой?

33. Koolen-De Vries syndrome (OMIM 610443) Chromosome 17q21.31 deletion syndrome

Обнаружены микроделеции участков длинного плеча 17 хромосомы в регионе 17q21.31, размер 564 kb и 537
kb соответственно. Подобные микроделеции являются причиной Koolen-De Vries syndrome (OMIM 610443)

34. Koolen-De Vries syndrome (OMIM 610443) Chromosome 17q21.31 deletion syndrome

Рекомендуется проводить дифференциальную диагностику с 5 синдромами: с. ПрадераВилли, с. Ангельмана, Велокардиофациальным с., с. Мартина-Белл,
Кардиофациокутанеальным с.

35.

ЧТО ОПРЕДЕЛЯЕТ КЛИНИЧЕСКУЮ ЗНАЧИМОСТЬ CNV?
• Включена ли CNV в базы данных нормальных вариаций?
• Содержит ли CNV область, делеция или дупликация
которой является причиной известного синдрома?
• Содержит ли CNV ген, делеция или дупликация
которого являются причиной известных синдромов?
• Каков общий генный контент или размер CNV?
• Является ли обнаруженная CNV вариацией de novo?
• Является ли CNV наследуемой?

36. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА СИНДРОМА СОТОСА

37.

Возраст,
пол
Характерн
ый
фенотип
Макросом
ия
Задержка
развития
ВПР
головного
мозга
ВПС
ВПР МПС
Размер
делеции
Молекуля
рный
кариотип
Пациент 1
Пациент 2
Пациент 3
Пациент 4
2 мес., ж
1 год, ж
1 мес., ж
3 года, м
Нет
Да
Нет
Нет
+
-
-
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
-
+
-
+
2 Mb
4,1 Mb
1,9 Mb
2,3 Mb
arr[hg19]
5q35.2q35.3(175438045_
177436413)x1
arr[hg19]
5q35.3(176607398_18
0719789)x1
arr[hg19]
arr[hg19]
5q35.2q35.3(175570677_1 5q35.2q35.3(175029372_1
77437651)x1
77324736)x1

38. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА СИНДРОМА СОТОСА

Синдром Вивера
Синдром Беквита-Видемана
Синдром Банаян-Райли-Рувалькаба
Дупликации 4p
Мозаичная трисомия 20p11.2-р12.1
Синдром делеции 22q13.3

39.

ЧТО ОПРЕДЕЛЯЕТ КЛИНИЧЕСКУЮ ЗНАЧИМОСТЬ CNV?
• Включена ли CNV в базы данных нормальных вариаций?
• Содержит ли CNV область, делеция или дупликация
которой является причиной известного синдрома?
• Содержит ли CNV ген, делеция или дупликация которого
являются причиной известных синдромов?
• Каков общий генный контент или размер CNV?
• Является ли обнаруженная CNV вариацией de novo?
• Является ли CNV наследуемой?

40. ГЕННЫЙ КОНТЕНТ И РАЗМЕР CNV

60000000
40000000
30000000
20000000
10000000
0
1
6
11
16
21
26
31
36
41
46
51
56
61
66
71
76
81
86
91
96
101
106
111
116
121
126
131
136
141
146
151
Размер CNV
50000000
Количество генов

41.

ЧТО ОПРЕДЕЛЯЕТ КЛИНИЧЕСКУЮ ЗНАЧИМОСТЬ CNV?
• Включена ли CNV в базы данных нормальных вариаций?
• Содержит ли CNV область, делеция или дупликация
которой является причиной известного синдрома?
• Содержит ли CNV ген, делеция или дупликация которого
являются причиной известных синдромов?
• Каков общий генный контент или размер CNV?
• Является ли обнаруженная CNV вариацией de novo?
• Является ли CNV наследуемой?

42. CNV: НАСЛЕДУЕМАЯ ИЛИ DE NOVO?

ХРОМОСОМНЫЙ МИКРОМАТРИЧНЫЙ АНАЛИЗ
ПОЗВОЛЯЕТ ВЫЯВЛЯТЬ МИКРОДЕЛЕЦИИ…
Пациент К., женщина 32 г.
Беременность 21 неделя. ВПС: тетрада Фалло у плода.
Материал: амниотическая жидкость
Обнаружена микроделеция 3p26.3. Размер: 1,4 Mb

43. CNV: НАСЛЕДУЕМАЯ ИЛИ DE NOVO?

44. КЛАССИФИКАЦИЯ CNVs

CNVs
Патогенные
LPAT
Вариации с неизвестной
клинической значимостью
Нет
подклассификации
LPAT – вероятно патогенные
LBEN – вероятно непатогенные
Непатогенные
LBEN

45. ПАТОГЕННЫЕ CNVs

• Описаны в базах OMIM и ORPHANET как
делеционный/дупликационный синдром
• Описаны в 2 и более рецензируемых
публикациях и/или базе DECIPHER у
пациентов со сходными клиническими
проявлениями

46. НЕПАТОГЕННЫЕ CNVs

• CNV была описана во многих
рецензируемых публикациях или
курируемых базах данных, как
непатогенная, особенно если ее
генетическая природа хорошо описана
и/или если она является распространённым
полиморфизмом

47. CNVs С НЕИЗВЕСТНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТЬЮ, ВЕРОЯТНО ПАТОГЕННАЯ

• CNV описана в единственной рецензируемой публикации,
но с чёткими границами и фенотипом, соответствующими
наблюдаемым у пациента.
• CNV описана как вероятно патогенная в рецензируемых
публикациях и базах данных у пациентов со сходными
клиническими проявлениями
• В регионе CNV имеется ген с известной функцией,
нарушение которой может привести к клиническим
проявлениям, сходным с наблюдаемыми у пациента.

48. CNVs С НЕИЗВЕСТНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТЬЮ, ВЕРОЯТНО НЕПАТОГЕННАЯ

• В районе CNV отсутствуют гены (но она была
включена в отчёт по причине большого размера
относительно стандартов лаборатории, либо по
причине наличия другой CNV, вместе с которой она
может иметь большую клиническую значимость,
например, сочетание терминальной делеции и
дупликации негомологичных хромосом).
• CNV присутствует у небольшого количества
индивидов в общепопуляционных базах данных, но
не является распространённым полиморфизмом.

49. CNVs С НЕИЗВЕСТНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТЬЮ, НЕТ ПОДКЛАССИФИКАЦИИ

• CNV содержит гены, однако неизвестно,
чувствительны ли они к изменению числа
копий;
• CNV представлена во многих противоречащих
друг другу публикациях и/или базах данных,
из-за чего невозможно сделать вывод о ее
клинической значимости.

50. НЕОЖИДАННЫЕ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ, НЕ ОТНОСЯЩИЕСЯ К ПРИЧИНЕ НАПРАВЛЕНИЯ

• Носительство CNVs, связанных с
рецессивными заболеваниями
• Носительство CNVs, связанных с
заболеваниями с поздним началом или не
диагностированными состояниями
• Носительство вариантов, ассоциированных
с риском неоплазии

51. НОСИТЕЛЬСТВО CNVs, СВЯЗАННЫХ С РЕЦЕССИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

• Обнаружена мутация в гене, связанном с хорошо
описанным в литературе рецессивным
заболеванием с достаточно высокой частотой
встречаемости в популяции, к которой относится
пациент, и/или при котором доступны
альтернативные методы диагностики (например,
муковисцидоз).
• Обнаружена мутация в гене, связанном с
рецессивным заболеванием с симптоматикой,
совпадающей с имеющейся у пациента.

52. НОСИТЕЛЬСТВО CNVs, СВЯЗАННЫХ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ С ПОЗДНИМ НАЧАЛОМ

• Сообщать или нет?
• Может ли пациент принимать такое
решение?
• Если сообщать, то о каких именно
состояниях?

53. НОСИТЕЛЬСТВО CNVs, СВЯЗАННЫХ С РИСКОМ НЕОПЛАЗИИ

• Сообщать или нет?
• Какие варианты могут быть включены в
отчет?

54. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ВНЗ

Вариации с неизвестной
клинической значимостью
Обследование
родителей
Родитель не
носитель
Родитель носитель
Болен
Здоров
Неполная пенетрантность
Варьирующая
экспрессивность
Эффекты импринтинга
Мозаицизм у родителя
CNV вероятно патогенная
или
CNV и болезнь
наследуются независимо
CNV вероятно
патогенная

55. Пациентка Р., 3 года Клинический диагноз: Буллезный эпидермолиз, простая форма в сочетании с костной патологией Обнаружено большое количес

Пациентка Р., 3 года
Клинический диагноз: Буллезный эпидермолиз, простая форма в сочетании с костной
патологией
Обнаружено большое количество протяженных участков с потерей гетерозиготности
(˃3 млн. п.н.) – 5,4%

56.

Мутации в области потери гетерозиготности могут быть причиной аутосомнорецессивных заболеваний
ФЕНОТИП
ПАЦИЕНТА
=
Фенотип
синдромов попадающих в зону
потери
гетерозиготности
=>
Анализ мутаций
связанных с
рецессивными
заболеваниями

57.

Пациентка Р., 3 года
Клинический диагноз: Буллезный эпидермолиз, простая форма в сочетании с костной
патологией
Обнаружено большое количество протяженных участков с потерей гетерозиготности
(˃3 млн. п.н.) – 5,4%

58. ЗАПИСЬ РЕЗУЛЬТАТОВ ХРОМОСОМНОГО МИКРОМАТРИЧНОГО АНАЛИЗА

• arr(1-22)x2,(X,Y)x1 – норма, мужской пол
• arr(1-22,X)x2 – норма, женский пол
• arr[hg19] 7p21.1p14.1(16817164_40301877)x3
• arr – array, указывает на то, каким методом был
выполнен анализ
• [hg19] – версия референсного генома
• 7p21.1p14.1 – локализация точек разрывов
• (16817164_40301877) – геномные координаты
• х3 – число копий в анализируемой области

59.

ПОКАЗАНИЯ К ХМА

60. ХМА В ПОСТНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

ХМА является тестом первой линии в постнатальной
диагностике причин МВПР с задержкой развития
или без нее при отсутствии у пробанда признаков
известных хромосомных, моногенных и других
синдромов.

61. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ CNVs ПО РАЗМЕРУ (пациенты с МВПР, ЗР, МАР)

450
401
400
350
300
250
226
200
150
100
50
74
46
0
0-200 kb
200-800 kb
800 kb - 8 Mb
МВПР – множественные врожденные пороки развития
ЗР – задержка развития
МАР – малые аномалии развития
более 8 Mb

62. КЛАССИФИКАЦИЯ CNV В РАЗЛИЧНЫХ ГРУППАХ ПАЦИЕНТОВ

120,0%
100,0%
80,0%
66%
60,0%
79,1%
Норма
ВНЗ
Патогенные CNVs
40,0%
3,3%
20,0%
5,8%
30,7%
15,1%
0,0%
МАР, ЗР
МВПР – множественные врожденные пороки развития
ЗР – задержка развития
МАР – малые аномалии развития
МВПР

63.

ЧАСТОТА НЕКОТОРЫХ СИНДРОМОВ В ГРУППЕ ИЗ 3299
ПАЦИЕНТОВ
35
31
31
30
25
20
15
10
5
0
14
14
10
9
8
8
7
7
6
6
5
5
5
5

64. КАК СДЕЛАТЬ ПРАВИЛЬНЫЙ ВЫБОР?

65.

ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
• Сбалансированные хромосомные перестройки
(транслокации, инверсии)
Ожидаем ли мы увидеть сбалансированную
перестройку у пробанда с МВПР?
• Точковые мутации
• Болезни экспансии тринуклеотидных повторов
• Микроделеции/микродупликации, размер которых
меньше разрешающей способности микроматрицы

66.

НУЖНО ЛИ ПОДТВЕРЖДАТЬ РЕЗУЛЬТАТЫ ХМА?
НЕТ!
Система Геноскан 3000 является единственной
апробированной полногеномной технологией и
оборудованием, которое используется для
молекулярно-цитогенетического анализа,
сертифицировано и имеет разрешение к
применению для диагностических целей.

67.

Клинический экзом и ХМА: различные задачи и принципы методов
Клинический экзом
Тщательное прочтение избранных
участков по разумной цене за счет
отказа от анализа >99.5% генома.
Метод создан для выявления
точковых мутаций в кодирующих
участках ~4800 генов.
ХМА
Детекция некоторых
хромосомных
перестроек – побочное
применение метода с
существенными
ограничениями
Из генома извлекаются
участки экзонов с помощью
сложной процедуры
Метод создан для выявления
хромосомной аномалии.
Охват практически 100% генома,
надежная детекция любых
перестроек в тщательно
валидированных пределах
чувствительности
Не выявляет точковые мутации
Максимально равномерный анализ
100% хромосомной ДНК
Остальные 99.5% участков ДНК отмываются и не анализируются

68.

Плотность анализируемых участков в клиническом экзоме не соответствует даже
самому дешевому варианту ХМА; их распределение крайне неравномерно
ХМА «Расширенный» – 2 696 550 точек
с. Вольфа-Хиршхорна (del4p; различные образцы), chr4
ХМА «Стандартный» – 750 436 точек
ХМА «Оптима» – 166 468 точек
Полный экзом – 214 115 отрезков
Разрывы до нескольких млн. п. о.
Клинический экзом – 62 309 отрезков
п.о.

69.

Эффективность выявления CNV в полноэкзомных данных по сравнению с ХМА
(сравнение программных алгоритмов) [Parker et al., 2016]
Специфичность
(доля находок в
полном экзоме,
подтвердившихся при
использовании ХМА)
Чувствительность
(доля находок ХМА,
детектированных и в
полном экзоме)
Packer JS, et al. Bioinformatics. 2016 Jan 1;32(1):133-5.
Максимальные значения – чувствительность 80.9% / специфичность 57.1% для
программы ExomeDepth и 65.4% / 78.4% для CLAMMS.
Из анализа исключены все аберрации, не затронувшие хотя бы 1 экзон.
Учитывая, что в клиническом секвенировании экзома анализу подвергается в 4
раза меньше генов, полученные величины для КСЭ были бы гораздо меньше.

70.

Секвенирование экзома, хотя уже подтвердило свою высокую эффективность в выявлении
точковых мутаций, пока является сравнительно новым методом, где только предстоит
выработка национальных рекомендаций. В общепризнанных рекомендациях ACMG
(American College of Medical Genetics and Genomics; Rehm et al., 2013) метод в принципе не
рассматривается с точки зрения детекции хромосомных микроперестроек.
ХМА, напротив, давно признан «золотым стандартом» молекулярной цитогенетики, как за
рубежом, так и в России; в частности, МГНЦ РАМН в 2015 г. опубликовано описание
медицинской технологии «Использование хромосомного микроматричного анализа для
повышения эффективности медико-генетического консультирования».
Это значит, что даже при успешной детекции аберраций с помощью NGS их необходимо
обязательно подтверждать референсным методом для постановки диагноза – в случае
совсем крупных делеций или дупликаций таковым может послужить кариотип, но в
большинстве случаев подтверждающим методом будет выступать ХМА.

71. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КОНСУЛЬТИРОВАНИЕ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ХМА

ПРОБЛЕМЫ
• Назначения врача не выполняются
• Завышенные ожидания от результатов анализа
• Пациенты получают результаты исследования до
того, как с ними может ознакомиться врач
• Нарушение требований к подготовке заключений
• Незнание или непонимание содержимого
заключения

72. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КОНСУЛЬТИРОВАНИЕ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ХМА

ОСОБЕННОСТИ
• Некоторые патогенные CNV наследуются
• Могут иметь неполную пенетрантность
• Выявление CNV с неизвестной клинической
значимостью требует проведения
дополнительных обследований
• Выявление патогенных CNV у пробанда –
основание для рекомендации пренатальной
диагностики
• Ложное отцовство, ВРТ с донорскими клетками

73. НАСЛЕДСТВЕННЫЕ СИНДРОМЫ И ОСЛОЖНЕНИЯ АНЕСТЕЗИИ (Merlin G. Butler et al. «Specific Genetic Diseases at Risk for Sedation/Anesthesia Complications» Anesth Analg 2000;91:837–55)

Возможные осложнения
Синдром
Нарушение
проходимости
дых. путей
Нарушение
механики
дыхания
Желудочный
рефлюкс
Сердечнососудистые
нарушения
Синдром
Ангельмана
Нервномышечные
нарушения
Болезни
печени
Болезни
почек
+
+
+
Синдром БеквитаВидемана
+
Синдром делеции
3p25-pter
+
Синдром делеции
4q31-qter
+
+
Синдром делеции
9p22-pter
+
Синдром делеции
22q11.2
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Синдром
дупликации 3q21qter
+
+
+
+
+
Синдром
дупликации 4p16.2p15.1
+
+
+
+
+
Синдром Вильямса
+
+
+
+
+

74.

ХРОМОСОМНЫЙ МИКРОМАТРИЧНЫЙ АНАЛИЗ В
ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ
ПОКАЗАНИЯ
• Высокий риск ХП по результатам НИПТ
• Ребенок с хромосомной патологией в семье
• Носительство сбалансированной
хромосомной перестройки у одного из
родителей
• Высокий риск ХП по результатам скрининга
• УЗ-маркеры ХП
• ВПР плода
ВОЗМОЖНОСТИ
• Анеуплоидии, триплоидии
• Микроделеции/микродупликации
• Несбалансированные транслокации
• Потеря гетерозиготности, ОРД

75.

• ХМА в качестве замены анализа
кариотипа рекомендован при
выявлении пороков развития плода
или мертворождении
• врач должен обсудить
преимущества и ограничения
анализа кариотипа и ХМА с
пациентами, которым показана
инвазивная процедура
• проведение пре- и посттестового
консультирования должен
проводить врач, имеющий опыт в
интерпретации результатов ХМА
пациенты должны быть
информированы об ограничениях
ХМА, а также о возможности
выявлять признаки родства
родителей
при выявлении ВНЗ рекомендована
консультация эксперта имеющего
доступ к базам данных для
выявления генотип-фенотипических
корреляций
не рекомендуется использование
ХМА в качестве теста первой линии
для диагностики причин потери
беременности в первом триместре

76. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ХМА В ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ

• УЗ-аномалии – 6,5%
• Возраст старше 35 лет – 1%
• Другие причины – 1,1%
от общего числа случаев с
нормальным кариотипом
плода
• УЗ-аномалии – 6%
• Другие причины – 1,7%
от общего числа случаев с
нормальным кариотипом
плода

77.

АНАЛИЗ CNV В ТКАНИ ОПУХОЛИ
ERBB2
77

78. АНАЛИЗ КАРИОТИПА, CGH ИЛИ ХМА

Сбалансированные
транслокации и
инверсии
Несбалансированные
транслокации
Триплоидии
AOH/
UPD
CNVs
Метод
Анеупло
идии
Анализ
кариотипа
+
+
+
+
-
-
aCGH
+
-
+
-
-
+
ХМА (SNP)
+
-
+
+
+
+