Технология рекомбинантных ДНК

1.

ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК.

2.

3.

4.

Рекомбинантная ДНК –
гибридная молекула ДНК, содержащая искусственно
введенный ген.

5.

Механизм создания рекомбинантной
ДНК
1. Рестрикция — разрезание ДНК
рестрикционной эндонуклеазой
(рестриктазой) на множество
различных фрагментов, но с
одинаковыми «липкими» концами.
Такие же концы получают при
разрезании плазмидной ДНК той же
рестриктазой.

6.

2. Лигирование — включение фрагментов ДНК
в плазмиды благодаря «сшиванию липких
концов» ферментом лигазой.
3. Трансформация — введение
рекомбинантных плазмид в бактериальные
клетки, обработанные специальным образом —
так, чтобы они на короткое время стали
проницаемыми для макромолекул.
4. Скрининг — отбор среди клонов
трансформированных организмов тех, которые
содержат плазмиды, несущие нужный ген.

7.

5 - бактериальный геном (кольцевая
ДНК, расположенная в нуклеоиде),
6 - ДНК с целевым геном, 7 - плазмида
(вектор).
1 - рестрикция ДНК
(разрезание ферментами
- рестриктазами),
2 - гибридизация ДНК
(объединение
фрагментов и их
сшивание -лигирование)
с образованием
рекомбинантной
плазмиды, 3 трансформация
бактериальной клетки
(перенос в нее
рекомбинантной
плазмиды),
4 - "липкие концы"
(комплементарные
одноцепочечные участки
ДНК),

8.

9.

Рестриктазы- ферменты, способные узнавать специфические
последовательности ДНК(4-6 нуклеотидов)

10.

11.

3. ДНК- полимераза – синтезирует нуклеиновые
кислоты.
4. Терминальная трансфераза – наращивает на
концах фрагмента ДНК однонитевые участки
путем последовательного присоединения
нуклеотидов; используется для создания на
соединяемых фрагментах ДНК «липких»
концов.
5. Нуклеазы – большой класс ферментов,
расщепляющих молекулы нуклеиновых
кислот; имеются нуклеазы, расщепляющие
одно- или двуцепочные ДНК и РНК путем
отщепления по одному нуклеотиду или
небольших олигонуклеотидов.

12.

Примеры лекарств, производимых с помощью биотехнологии:
Activase – для разрушения тромбов в кровеносных сосудах
Herceptin – лечение рака молочной железы
Neutropin, Humatrope – лечение недостатка гормона роста
Xolair – лечение аллергической астмы
Rativa, Amevive – лечение псориаза
Epogen и Procruit – лечение анемии
Enbrel, Humira, Remicade – лечение ревматоидного артрита
Avonex, Betaseron – лечение множественного склероза
Recombivax – вакцина против гепатита В
Flumist – вакцина против гриппа
Forteо – лечение остеопороза
Reopro – предотвращает тромбообразование
Xigris – лечение сепсиса

13.

Рекомбинантные белки, которые используют в
терапевтических целях.
Год
Продукт
1982
Человеческий
инсулин
Гормон роста
человека
1985
Клиническое
применение
Диабет
Карликовость
1986
Вакцина гепатита В
1989
Эритропоэтин
Профилактика
гепатита В
Анемия
1992
Фактор VII
Гемофилия А
1997
Фактор IX
Гемофилия В
1999
Фактор VIIa
Гемофилия

14.

Некоторые рекомбинантные белки, синтезируемые
в клетках насекомых:
-a-интерферон
- эритропоэтин
- щелочная фосфатаза человека
- липаза поджелудочной железы человека
- интерлейкин-2
- активатор тканевого плазминогена
- регулятор проницаемости мембран, нарушения
в котором приводят к муковисцидозу

15.

Клетки млекопитающих
Созданы экспрессирующие векторы для культуры
клеток млекопитающих
Промышленный синтез рекомбинантных
белков с использованием модифицированных
клеток млекопитающих обходится слишком дорого
Системы экспрессии на основе клеток
млекопитающих
используют
для
получения
рекомбинантных белков, которые невозможно получить
с помощью других систем получения

16.

Получение определенных лечебных белков может быть достигнуто
только с помощью культуры клеток млекопитающих, где белок
соответствующим образом укладывается и модифицируется
Выработка этого белка в трансгенных животных
может быть альтернативным методом

17.

Методы получения трансгенных животных
Микроинъекция клонированных
генов производят в один или оба
пронуклеуса только что
оплодотворенной яйцеклетки мыши.
Чаще выбирают мужской
пронуклеус, привнесенный
сперматозоидом, так как его размеры
больше.
После инъекции яйцеклетку немедленно
имплантируют в яйцевод приемной матери,
или дают возможность развиваться в культуре
до стадии бластоцисты, после чего
имплантируют в матку.

18.

19.

Эмбрион находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным
ретровирусом, несущий трансген. Самки, которым был импортирован
эмбрион, производят на свет трансгенное потомство.для идентификации
мышей, несущих трансген в клетках зародышей линии, проводят ряд
скрещиваний.

20.

Клонирование овцы методом переноса ядра. Эпителиальные клетки молочной
железы в культуре индуцируют для перехода в фазу G0 (стадия, на которой
находится яйцеклетка). Затем осуществляют слияние такой клетки с
энуклеированной яйцеклеткой и выращивают эмбрионы до ранних стадий
эмбриогенеза. После чего эмбрионы имплантируют в матку суррогатной матери,
где происходит дальнейшее развитие. В экс.Я. Уилмута (I. Wilmut) по
клонированию Долли было проведено 277 слияний безъядерных яйцеклеток с
клетками молочной железы в фазе G0, из 29 выживших эмбрионов только один
развился до жизнеспособного организма

21.

1) получение столбнячного (дифтерийного)
токсина
2) введение лошади столбнячного токсина
3) появление иммуноглобулинов в крови лошади
4) получение плазмы крови
5) удаление фибриногена и очистка препарата

22.

23.

https://research-journal.org/archive/6-37-2015-july/polucheniemonoklonalnyx-antitel
Получение моноклональных антител. Методы