Получение рекомбинантных белков

1.

Получение рекомбинантных
белков
Выполнил: ст. гр. МТБ02-23-01
Потапова Д.Е.
Принял: проф., д-р хим. наук
Зорин В.В.

2.

Актуальность
2
Получение рекомбинантных белков заключается в том, что гены
человека, животных или растений помещаются в генетический
материал клеток бактерий, млекопитающих или дрожжей, и эти
микроорганизмы могут использоваться как продуценты белков для
медицинских, научных и исследовательских целей.
Рекомбинантные технологии позволяют не только получить продукт с
высоким выходом, но и конструировать биомолекулы с заранее
заданными параметрами. Открытие технологии рекомбинантных
ДНК позволило использовать в практической медицине множество
белковых и пептидных препаратов, значительно повысив их
доступность.

3.

Получение рекомбинантных белков
3
получение чужеродной ДНК;
разрезание полученной ДНК на фрагменты и их очистка;
включение фрагмента чужеродной ДНК в векторную
плазмиду и получение рекомбинантной ДНК;
введение рДНК в клетки и клонирование генов;
амплификация и экспрессия ДНК.

4.

Преимущества и недостатки бактериальных
клеток
Плюсы
4
Минусы
Высокая плотность
культуры
Получаемые белки часто токсичны для бактерий
Невысокая стоимость
Белки могут получаться в неактивной форме
Простота культивирования
Белок может быть загрязнен пирогенами
Большинство хорошо изучены
Для работы эукариотических белков
требуются особые модификации

5.

Выделение генов из ДНК
5

6.

Вектор – молекула ДНК, опосредованно
переносящая введенный ген в геном реципиента.
Для создания векторов для переноса чужеродной ДНК
используют плазмиды, бактериофаги, вирусы.
Требования:
- обеспечивать репликацию
чужеродного фрагмента ДНК
- иметь уникальные сайты
рестрикции
- содержать генетический
маркер для отбора
рекомбинантных клонов
6

7.

7
Основные
элементы
экспрессионной
плазмиды:
1. Сайт инициации
репликации
2. Селективный
маркер
3. Экспрессионная
кассета

8.

8
Маркеры
Негативная селекция
Устойчивость к
антибиотикам
Позитивная селекция
Нарушение биосинтеза
суицидального белка
Сине-белый тест

9.

Создание рекомбинантной плазмиды
9

10.

Во время трансформации специально подготовленные
бактериальные клетки подвергаются так называемому шоку
(например, сильному нагреванию), который побуждает их
поглощать чужеродную ДНК.
10

11.

ПЦР (полимеразная цепная реакция)
Распространенный лабораторный
метод, используемый для создания
множества копий определенного
участка ДНК.
ДНК-полимераза, обычно используемая
в ПЦР, называется Taq полимераза.
Целью ПЦР является получение такого
количества целевого фрагмента ДНК,
которое можно проанализировать или
исследовать другим способом.
ДНК далее может быть отправлена на
секвенирование, визуализирована
электрофорезом в геле или
клонирована в плазмиду для
дальнейших экспериментов.
11

12.

Секвенирование генов
12
Секвенирование ДНК — это
процесс определения
последовательности
нуклеотидных оснований
(A, T, C и G) в фрагменте
ДНК.
Виды:
- Секвенирование по
Сэнгеру (метод обрыва
цепи);
- Секвенирование нового
поколения.

13.

Выращивание культуры и синтез белка
13
После синтеза белка бактериальные клетки расщепляются, чтобы
высвободить его. Но помимо целевого белка в бактериях есть
множество других макромолекул, поэтому целевой белок следует
очистить или отделить от остальных.

14.

14
Спасибо за внимание!