Регуляция везикулярного транспорта (Лекция 1)

1.

РЕГУЛЯЦИЯ
ВЕЗИКУЛЯРНОГО
ТРАНСПОРТА
Елена Сергеевна Корнилова
Лаборатория динамики внутриклеточных
мембран
Институт цитологии РАН, С.-Петербург

2.

Транспорт макромолекул между клеточными
компартментами

3.

Press Release
The Nobel Assembly at Karolinska Institutet
has today decided to award
The 2013 Nobel Prize in Physiology or Medicine
jointly to James E. Rothman, Randy W. Schekman
and Thomas C. Südhof
for their discoveries of machinery regulating vesicle
, major transport system in our cells
The three Nobel Laureates have discovered the molecular principles
that govern how this cargo is delivered to the right place at the right
time in the cell.

4.

Везикулярный транспорт – это
перенос макромолекул-грузов,
«упакованных» в мембранные
пузырьки, или везикулы, от одного
мембранного компартмента клетки к
другому.
Грузами могут быть как белки, так и липиды
В этом процессе участвуют все мембранные
компартменты, кроме митохондрий

5.

Компартмент:
Имеет характерную морфологию,
постоянный липидно-белковый состав,
выполняет набор определенных функций
существует постоянно ( preexisting) –
стабилен
Транспортная везикула:
Несет груз, возникает на мембране
компартмента-донора и исчезает после
слияния с компартментом-мишенью

6.

Основные стадии транспортного процесса
Мембрана-донор
1
Сборка
транспортной
везикулы
(budding)
2
3
Рециклирование
регуляторных
транспортных белков
транспортировка
нацеливание/узнавание/сближение/
заякоривание
(targeting/recognition/tethering/docking) Акцептор
(мишень)
1.
4
Слияние
(fusion)
Белки окаймлений (COPI, II, клатрин-зависимые etc.)
Белки-грузы, рецепторы грузов
Регуляторные транспортные белки, обеспечивающие прохождение дальнейших
стадий (Rab-белки)
2.
3+4.
МТ, актиновые структуры
Rab-белки и их эффекторы, NSF-SNAP-SNARE система

7.

Внутриклеточные транспортные потоки

8.

Эндоцитозный путь: интернализация, рециклирование, трансцитоз,
путь лизосомальной деградации
Ретроградный путь

9.

Эндоцитозный, или ретроградный путь – это путь от
плазматической мембраны внутрь клетки
Ранние эндосомы – основная сортирующая станция на
эндоцитозном пути
доставка в TGN
Рециклирование
(возврат на ПМ)
фагоцитоз
Переход в поздние
эндосомы (вступление
на путь лизосомной
деградации)
трансцитоз

10.

Биосинтетический и секреторный (или экзоцитозный) путь
антероградный путь
ЭПР

11.

Основная часть биосинтетического пути –
от ЭПР к цис-Гольджи, через цистерны Гольджи до
транс-сети Гольджи (trans-Golgi network, TGN)
TGN – основная сортирующая станция на
биосинтетическом пути
другие
органеллы
секреция
доставка на
апикальную или
базолатеральную
ПМ
(экзоцитоз)
ранние и
поздние
эндосомы
лизосомы

12.

В ходе везикулярного транспорта идет постоянный
процесс сортировки компонентов мембран:
т.наз.резидентные компоненты удерживаются в
мембране органеллы, тогда как компоненты-«грузы»
исключаются из нее
пример: аппарат Гольджи
При огромном потоке синтезированных de novo белков,
перемещающихся из цис-цистерн в транс-цистерны, сами
цистерны сохраняют свою идентичность (т.е. определенный набор
белков и липидов)

13.

Тонко отлаженный баланс транспортных
потоков “in-out” позволяет нам думать,
что в клетке существуют стабильные
компартменты
на самом деле они являются
высокодинамическими структурами

14.

Брефельдин А – блокирует транспорт из ЭПР в Гольджи, не
влияя на транспорт в обратном направлении
+BrefA 10’
ERD2

15.

Sciaky et al., 1997, JBC 139
(5)
Brefeldin A
GFP-GalTase in HeLA
4 sec
intervals

16.

Sciaky et al., 1997, JBC 139 (5)
Brefeldin A
В присутствии микротрубочек
GFP-GalTase in HeLA
МТ разобраны Нокодазолом
Брефельдин А – блокирует транспорт из ЭПР в Гольджи,
не влияя на транспорт в обратном направлении

17.

Зачем нужен везикулярный транспорт?
определяет белковый и липидный состав органелл,
перенося молекулы-грузы от одного компартмента к
другому, «housekeeping functions”
Координирует внутриклеточные сигнальные
сети («в нужном месте в нужное время»)
выполняет специализированные
внутриклеточные функции
напр., репарация мембран клеток
скелетных мышц
Обеспечение подвижности клетки
Работает на организм в целом (секреция, пигментация,
синаптическая передача, фагоцитоз, ……)
Нарушения регуляции везикулярного транспорта выявляются в
ряде тяжелых патологий ( нейродегенеративные заболевания,
иммунные нарушения, ретинопатии, умственная ретардация,
инфекционные заболевания и т.д.

18. Суперсемейство малых ГТФаз

сигналинг
Ras
Rab
Регулируют
Ran
ARF
Импорт в
ядро
разные
стадии
везикулярного
Rac
Rho
транспорта

19.

Малые ГТФазы
20-30 kDa
Гипервариабельный домен
низкая собственная скорость гидролиза
ГТФ
Эффекторы GEF
ГТФ-связывающие домены
Изопренильный
гидрофобный хвост
“off”
GEF
“on”
Rabaptin5
EEA1
ГДФ
ГТФ
GAP
Эффекторы GAP
TRAPP, Exocyst,…
Специфическое взаимодействие с
мембраной-мишенью (“tethering”) –
первая стадия слияния мембран
или
Cell’s “top-managers”
p150 стимуляция иных клеточных
реакций

20.

МЕТОДЫ
1. Микроскопия (флуоресцентная, электронная)
2. Фракционирование (дифференциальное, в
градиентах плотности
3. Биохимические методы
4. Системы in vitro
Генно-инженерные подходы
Методы системной биологии, моделирование

21.

Генно-инженерные методы :
мутантные формы белков
Нокауты
siRNA
Флуоресцентные методы
Окраска антителами фиксированных клеток
конструкции «белок-GFP»
комплексы лигандов с флуорофорами
(Cy3 Alexa, QDs)

22.

23.

ФИ-3-киназа р85 отвечает на действие ЭФР, но не колокализуется с рецептор-содержащими эндосомами.
ЭФР-Р
0 мин
15 мин
60 мин
90 мин
р85

24.

15 мин после стимуляции эндоцитоза в клетках А431
Тубулин
р85
тубулин + р85

25.

Leica TCS SP5

26.

Проблема лимитов разрешения
15 мин
30 мин
60 мин

27.

МТ в
фиксированых
клетках
МТ в живых клетках
(альфа-тубулин-EGFP)

28.

Электронная микроскопия: тонкая структура, но маленькое поле;
артефакты при обработке
ЭФР-ФЭ 15 мин 37 оС
ЭФР-ПХ,
N
ЭФР-ФЭ 15 мин 37 оС,
3 ч 18оС
3 ч 18оС

29.

30.

Фракционирование:
Разделение поздних эндосом и лизосом при
центрифугировании в градиенте Перколла
125I-ЭФР,
cat D
NAGA
30 мин
ЛИЗ+ПЭ
30
РЭ ПМ
17% Перколл
1.15
20
1.05
0
0.95
0
10
20
ПЭ
ЛИЗ
20
1.2
33% Перколл
1.1
10
1
0
0.9
0
10
номер фракции
20
(---) плотность, г/мл
активность, %
10

31.

Динамика компартментализации и деградации ЭФР в клетках А431
125I-ЭФР,
60 мин 4 оС > 37 оС > + Na-ацетатный буфер, рН 4.5
Лиз
125I-ЭФР
(17% Перколл)
- рН 4.5
ЭПР
Г ПМ
+рН 4.5
ЭФР-родамин
5
4
3
1
2
2
0 мин
1
0
3
Ранние
эндосомы
5 мин
1
0
3
2
15 мин
1
Поздние
эндосомы
и
лизосомы
0
3
2
30 мин
1
0
деградация 125I-ЭФР
3
60 мин
1
0
3
90 мин
2
1
I в среде, отн.ед
60
2
125
радиоактивность, отн.ед
2
50
40
30
20
10
0
0
0
20
40
60
вре мя, мин
0
5
10
15
фракции
20
80
100

32.

Разделение органелл в градиенте Перколла с
последующей ЕМ фракций
Total membranes
РЭ
ПЭ
ПМ
Лиз

33.

Степень ассоциации Rab7 c ПЭ коррелирует с
эффективностью сортировки рецептора ЭФР
ЭФР- Р
Rab7
РЭ
ПЭ+Л

34.

На поздних стадиях эндоцитоза области локализации Rab7 и активно
сортирующегося рецептора ЭФР пересекаются
А431
EGFR
60 мин ЭФР
Rab7
EGFR
merge
10 мин
WT
30 мин
CD126
180 мин
KN
Rab7

35.

Вортманнин приводит к накоплению в околоядерной области
укрупненных везикулярных структур
ЭФР-Р
контроль
Клетки А431
вортманнин
контроль
0 мин
ТФ-Р
15 мин
ERD2
60 мин
90 мин
вортманнин