Питательные среды и растворы, применяемые при культивировании клеток

1.

Питательные среды
и растворы,
применяемые при
культивировании клеток
Бакулина Людмила Федоровна, научный сотрудник
отдела Научно-методической подготовки персонала
по работе с возбудителями ООИ
1
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

2. При выращивании клеток используются:

• питательные среды для
культур клеток,
• сыворотки,
• бессывороточные
среды,
• антибиотики,
• ростовые факторы,
• растворы для
диссоциации клеток,
• буферные растворы,
• среды и растворы
специального
назначения.
2
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

3. Cреды условно делят на три группы:

• естественные ПС - состоящие из
естественных биологических жидкостей
(кровь, лимфа, амниотическая жидкость и
др.);
• синтетические ПС, состоящие полностью
из химических компонентов (аминокислот,
витаминов, неорганических солей);
• полусинтетические ПС, состоящие из
химических компонентов и, частично, из
компонентов биологического
происхождения (гидролизатов различных
белков).
3
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

4. Первые питательные среды

1885 г. - Теплый физиологический раствор.
1897 г. - Сыворотка и плазма крови.
1907 г. - Лимфатический тромб.
1910 г. - Тромб плазмы курицы.
1913 г. - Плазма крови, обогащенная
экстрактом эмбриона.
4
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

5. Состав питательной среды

• Неорганические соли- 10 г
• Углеводы -1 г
• Аминокислоты - 0,5 г
• Витамины - 0,01 г
• Вода - до 1 л
5
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

6. Система финишной очистки

• Milli-Q
6
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

7. Раствор Эрла – сильный буфер с высокой концентрацией бикарбоната натрия (6 солей, глюкоза, феноловый красный). Используется в

системах с
повышенным парциальным
давлением СО2.
Раствор Хенкса – в 6 раз меньше
бикарбоната (7 солей, глюкоза,
феноловый красный).
Предназначен для поддержания рН
в плотно закрытых сосудах.
7
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

8. Неорганические соли обеспечивают:

• необходимое осмотическое
давление,
• ионный баланс,
• определенный рН,
• буферную емкость среды.
8
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

9. Аминокислоты

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Аргинин
Валин
Глутамин
Гистидин
Изолейцин
Лейцин
Лизин
Метионин
9. Треонин
10. Триптофан
11. Тирозин
12. Фенилаланин
13. Цистин
9
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

10. В составе ПС аминокислоты выполняют следующие функции:

• включаются в белок,
• при необходимости превращаются в другие
аминокислоты,
• служат исходным материалом для построения
нуклеиновых кислот;
• служат источником энергии, если количество
глюкозы падает ниже критического уровня.
Синтез белка и размножение клеток в культуре
может происходить при концентрация незаменимых
аминокислот в клетках не ниже 0,01 – 0,04 мМ.
Общая концентрация всех свободных
аминокислот в ПС должна достигать 0,1-0,2 мМ.
10
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

11.

Витамины
Большинство наиболее важных витаминов,
необходимых для нормального роста
клеток, принадлежит к группе В:
никотинамид (В5), тиамин (В1),
пантотеновая кислота (В3), пиридоксин
(В6), рибофлавин (В2), фолиевая кислота
(В9), холин (В4), инозит (В8), биотин (Н).
Из жирорастворимых витаминов чаще
всего в состав питательной среды
включают витамины:
А (ретинол), Д (кальциферол), Е
(токоферол) и К (нафтохиноны).
11
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

12. Углеводы

D-глюкоза служит источником энергии и
метаболитом
для
синтеза
некоторых
аминокислот,
нуклеиновых
кислот.
Концентрация
глюкозы
в
ПС
может
существенно влиять на скорость роста
клеток.
Глюкоза может быть заменена и другими
углеводами.
Клетки способны утилизировать фруктозу,
галактозу, маннозу.
12
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

13. Часто используемые питательные среды

Питательная
среда
Особенности состава и применение
Среда 199
Многокомпонентная
среда,
использовалась
производства
полиовируса.
Рекомендуется
применения в диагностике вирусных инфекций.
Минимальная
Игла MEM
По сравнению с ВМЕ в 5 раз увеличено содержание
аргинина, в 4 раза - гистидина, двукратный набор
остальных аминокислот, кроме глутамина, удален
биотин. Используется для культивирования
среда
для
для
большинства перевиваемых линий клеток
ВМЕ-диплоид
Основная среда Игла для культивирования
диплоидных клеток.
13
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

14.

Среда Хэма,
F-10, F-12
При добавлении сыворотки представляет собой одну из
самых распространенных питательных сред, пригодную
для выращивания большинства клеточных линий.
Среда Мак-Коя, Среда используется для культивирования лейкоцитов,
(RPMI-1629)
материала
биопсий
и
наиболее
требовательных
первичных и перевиваемых культур. Требует добавления
10-30% эмбриональной сыворотки.
Среда Фишера
Поддерживает рост ряда линий лейкемических клеток.
Среда
Лейбовица
L-15
В буферной системе отсутствует бикарбонат натрия, что
позволяет выращивать клетки в условиях контакта с
открытой атмосферой. Глюкоза заменена галактозой.
14
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

15. Гидролизатные среды

— продукты гидролиза мяса, молока,
дрожжей, крови и др. белковых
веществ. Содержат необходимый для
культивирования клеток набор
аминокислот, витаминов,
микроэлементов. Из этих сред
широко используют гидролизаты
лактальбумина и мышечных
белков.
15
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

16. Для получения гидролизатов используют:

• белки сыворотки молока;
• мышечные белки;
• отходы производства гриппозной вакцины
и гамма-глобулина;
• растительные белки (сои, гороха, риса).
Данные гидролизаты содержат от 13 до 18
аминокислот, в том числе все незаменимые
аминокислоты и пептиды.
16
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

17. Примеры гидролизатных сред

• Питательная среда с гидролизатом
мышечной ткани ластоногих в растворе
Хенкса стерильная жидкая Целат;
• Питательная среда с гидролизатом
мышечной ткани плодов коров в растворе
Хенкса стерильная жидкая Гидрофет;
• Питательная среда с гидролизатом строжки
кожи млекопитающих в растворе Хенкса
стерильная жидкая Эпидермат-2-КРС и
Эпидермат-2-ЛАСТ;
• Питательная среда с гидролизатом
мозговой ткани крупного рогатого скота в
растворе Хенкса стерильная жидкая
Церебрат.
17
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

18. Основные компоненты сыворотки

Белки плазмы: альбумины, фибронектин,
альфа 2-макроглобулин, фетуин, трансферрин.
Полипептидные факторы роста: инсулин,
инсулиноподобные факторы роста I и II,
глютатион.
Гормоны: кортизол, гидрокортизон, эстрогены,
андрогены, тиреоидные гормоны.
Липиды: линоевая кислота, холестерин,
простагландины.
Метаболиты: аминокислоты, полиамины,
альфа-кетокислоты.
Минеральные вещества: железо, цинк, медь,
кобальт и др.
18
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

19. Сыворотки, используемые для культур клеток

• Сыворотка крови крупного рогатого скота
жидкая и сухая;
• сыворотка крови свиней для культур клеток;
• сыворотка крови северных оленей для культур
клеток;
• сыворотка крови суягных овец;
• сыворотка крови телят для культур клеток;
• сыворотка плодов коровы (эмбриональная);
• сыворотка крови человека.
19
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

20. Функции сыворотки в ПС (положительные)

• источник питательных веществ, витаминов,
аминокислот, гормонов и факторов роста,
транспортных и связывающих белков, факторов
прикрепления и специфических ингибиторов
протеаз;
• обладает важными буферными свойствами,
выполняет стабилизирующую и детоксицирующую
роль;
• сывороточный альбумин - неспецифический
ингибитор протеолиза, связывает
жирорастворимые витамины и стероидные
гормоны, которые могут быть токсичными в
свободной форме;
• компоненты сыворотки могут связывать тяжелые
металлы и активные органические соединения.
20
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

21. Функции сыворотки в ПС (отрицательные)

• нестабильное качество;
• высокая цена;
• потенциальная возможность контаминации
вирусами, микоплазмами, бактериями;
• опасность инфицирования прионами препаратов,
получаемых на культурах клеток с
использованием сыворотки крови животных.
21
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

22. Варианты бессывороточных сред

• Среда без сыворотки, но обогащенная
различными белками и экстрактами животного и
неживотного происхождения- Serum-free media
(SFM).
• Среда без сыворотки или белков животного
происхождения - Animal component free (ACF).
• Среда без белков, но с добавлением
гидролизатов дрожжей или растений - Protein
free media (PFM).
• Среда с добавлением низкомолекулярных
химически определенных компонентов Chemically defined media (CDM).
22
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

23. Преимущества и недостатки бессывороточных сред

+
• Стандартность сред и
упрощение их
проверок;
• воспроизводимость
результатов;
• упрощение процесса
очистки клеточных
продуктов;
• отсутствие митогенных
ингибиторов;
• снижение риска
контаминации.
-
• Повышенная
чувствительность
клеток к стрессовым
воздействиям и
обработке трипсином.
• Необходимость
адаптации клеток к
таким средам.
• Возможное снижение
скорости роста
культуры.
23
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

24. Примеры бессывороточных ПС

• UltraMDCK - для работы с почечными клетками;
• Insect-XPRESS - для работы с клетками
насекомых;
• UltraDOMA -для работы с гибридомами;
• UltraMEM без L-глутамина, безбелковая основная
среда;
• ProVero 1, бессывороточная среда для клеток
Vero и MDCK, без компонентов животного
происхождения;
• Pro293™a-CDM, бессывороточная среда для
адгезивных клеток 293.
• OptiPromSFM – для наработки вирусов в
монослое клеток Vero, MDCK, ВНК-21, МDBK.
• UltraCULTURE™ - Бессывороточная среда для
общих целей
24
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

25. Набор ProMEDIA SELECT

разработан фирмой BioWhittaker для приготовления
безбелковой и бессывороточной среды, не
содержащей компонентов животного происхождения,
которая:
улучшает рост клеток и их жизнеспособность;
поддерживает высокую плотность клеток и высокую
жизнеспособность;
повышает продукцию белка;
облегчает очистку продукта;
снимает необходимость собственных расходов и
усилий на разработку среды.
Набор содержит 16 точных прописей без компонентов
животного происхождения, предназначен для клеток
СНО.
25
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

26. Эволюция сред для культур клеток

Среда без компонентов животного происхождения
Эволюция сред для
культур клеток
Среда без
компонентов
животного
происхождения
Химически
определенная среда
без компонентов
животного
происхождения
Среда без
белков
Химически
определенная
среда
Среды без
сыворотки
Среда +
сыворотка
Химически определенная среда
26
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

27. Индикатор рН – феноловый красный

Индикатор в питательные среды добавляют для того,
чтобы контролировать кислотность среды в любой момент
времени.
Клетки в процессе роста подкисляют среду, и индикатор
приобретает желто-оранжевое окрашивание.
27
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

28. Поддержание рН среды

• бикарбонатный буфер - используется для
поддержания рН в большинстве сред: HCO3
= CO2 + OH-, если выделяется углекислый
газ, увеличивается концентрация ОН-.
• HEPES = 4-(2-оксиэтил)1пиперазинэтансульфоновая кислота в
концентрациях 0.01- 0.03 М; . HEPES легко
растворим в воде, не связывает
двухвалентные катионы, не цитотоксичен
до концентрации 0.05М.
• буферная емкость свободных аминокислот;
• сыворотка.
28
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

29. Антибиотики

- химические соединения биологического
происхождения (продуцируются грибами,
бактериями) или их синтетические
аналоги, оказывающие угнетающее или
губительное действие на различные
микроорганизмы (бактерии, простейших и
др.). Первый эффективный антибиотик –
пенициллин - открыт А. Флемингом в
1929.
29
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

30. Задача антибиотиков – защита от микроорганизмов

• Бактерицидное – вызывают гибель
микроорганизмов;
• бактериостатическое – приводит к
прекращению их роста и
размножения;
• бактериолитическое – вызывает
гибель и разрушение бактерий.
30
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

31. Используемые антибиотики

Наименование
Спектр действия
Пенициллин
Большинство Г+
и некоторые Г-
Стрептомицин
Большинство Ги некоторые Г+
Линкомицин
Г+, устойчивые
к пенициллину
Многие Г+ и Г-
Гентамицин
Канамицин
Широкий спектр
антибактериального действия
Нистатин
фунгистатическое,
фунгицидное действие.
31
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

32. Свойства антибиотиков

Антибиотик
Температ
ура
хранения
Рабочая
концентра
ция
Стабильнос
ть при 370С
Амфотерицин B
-20oC
2.5 мкг/мл
~3 дня
Ампицилин
4oC
100 мкг/мл
~3 дня
Гентамицин
4oC
50 мкг/мл
~5 дней
Канамицин
-20oC
100 мкг/мл
~5 дней
Неомицин
-20oC
50 мкг/мл
~ 5 дней
Пенициллин
-20oC
100 ед/мл
~3 дня
Стрептомицин
-20oC
100 мкг/мл
~3 дня
32
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

33. Ростовые факторы

Ростовые факторы - это
высокоспецифичные белки
сыворотки; при необходимости
большинство из них вносится в
питательные среды в очень
незначительных количествах:
10-9 - 10-11 М. Функцией ростовых
факторов является прежде всего
стимуляция пролиферации клеток и
клеточного метаболизма.
33
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

34. Примеры ростовых факторов

• эпидермальные ростовые факторы,
• факторы роста стволовых клеток,
• факторы роста фибробластов,
• факторы роста гепатоцитов,
• инсулиноподобные факторы роста,
• тромбоцитарные факторы роста,
• трансформирующие факторы роста,
• эритропоэтин.
34
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

35. Растворы для диссоциации клеток (1)

• Трипсин - от греч. tripsis – размалывание
- компонент сока поджелудочной железы,
переводящий белки в более простые,
растворимые соединения.
• Трипсин и химотрипсин протеолитические ферменты
поджелудочной железы позвоночных
животных, расщепляют пептидные связи
(трипсин по остаткам Lys и Arg,
химотрипсин по остаткам Tyr, Phe и Trp),
способствуя расщеплению белков до
аминокислот и мелких пептидов.
• Химопсин является препаратом
протеолитического действия, состоит из
смеси химотрипсина и трипсина.
35
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

36.

Растворы для
диссоциации клеток (2)
Раствор версена - это раствор
этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
Отмывает двухвалентные катионы с
поверхности клеток в культуре, способствуя
снятию клеток с подложки.
Смесь 0,25%-ного раствора трипсина и
0,02%-ного раствора версена применяют:
•для получения первичных культур;
•для дезагрегации монослоя при пересеве
монослойной клеточной культуры.
При пересеве используют смесь растворов
трипсина и версена в соотношении 1:1-1:9.
36
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

37. Растворы для диссоциации клеток (3)

• Проназа - рекомендуется для получения
первичных культур, обеспечивает
лучшее по сравнению с трипсином
образование суспензии одиночных
клеток. При работе с клеточными
линиями проназу следует использовать с
осторожностью.
• Коллагеназа - обладает минимальным
повреждающим действием на клетки, в
связи с чем она используется для
получения клонов клеточных культур.
• Гиалуронидаза – для выделения
хондроцитов.
37
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

38. Неферментные реагенты для снятия клеток

• Accutase - cмесь протеолитических и
коллагенолитических ферментов для отделения
клеток культуры на пластике, не содержит
компонентов бактериального или животного
происхождения.
• Accumax - смесь протеолитических,
коллагенолитических ферментов и ДНКазы для
получения клеточных суспензий из
агглютинированных клеточных культур, а также
отделения клеток от ткани. Не содержит
компонентов бактериального или животного
происхождения.
• Рабберы.
38
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

39. Готовые питательные среды

поддерживающие
ростовые
назначение:
обеспечение адгезии
и активного роста
клеток в культуре на
поверхности или во
взвешенном
состоянии в
суспензии
назначение:
обеспечивание
переживания клеток
в сформированном
монослое или суспензии
при репродукции
вирусов
39
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

40. Поддерживающие среды

• Жидкие - с пониженным
содержанием сыворотки или без
нее.
• Полужидкие – с пониженным
содержанием сыворотки и
добавлением небольшого
количества агара.
• Твердые - с пониженным
содержанием сыворотки и
добавлением агара, без красителя.
40
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

41. Сухие питательные среды

41
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

42. Гранулированные питательные среды

Образец
гранулированной
среды растворяется
4 мин, сухой –
более 18 мин.
42
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

43. Среды специального назначения

Транспортные среды для доставки
образцов для диагностики.
Среды для замораживания и
хранения клеток.
Селективные среды — питательные
среды, на которых могут расти лишь
клетки с определенными свойствами.
Кондиционные среды.
Среды для клонирования клеток.
43
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

44.

Транспортная Среда CVTR сделана на основе
среды 199 и содержит белки-протекторы,
антибиотики для подавления микробной
контаминации и буфер для поддержания pH,
феноловый красный.
Грипп:
• Среда 199 - 200 мл;
• Альбумин бычий – 13,5 мл;
• HEPES – 5 мл;
• Гентамицин – 1 ампула.
Краснуха основной раствор Хенкса рН 7,4 с
HEPES - буфером;
- бычий сывороточный альбумин;
- раствор антибиотиков;
- 0,4%-й раствор фенолового красного.
44
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

45.

• Транспортная среда M4RT, M4.
• Транспортная среда с глицеролом:
PBS смешать 1:1 с глицеролом;
к этой смеси добавить антибиотики:
пенициллин, стрептомицин, полимиксин,
гентамицин, нистатин, офлоксацин HCl,
сульфаметоксазол.
45

46. Среда для замораживания и хранения клеток

• Сыворотка -10-30 мл;
• Глицерин или ДМСО – 10 мл;
• Среда (199, Игла МЕМ и др.) –
до 100 мл.
46
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

47. Селективные среды

- питательные среды,
на которых могут
расти лишь клетки с
определенными
свойствами.
ГАТ-среда (HAT),
содержит гипоксантин,
аминоптерин,
тимидин.
47
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

48. Специфические среды

Питательная среда для культивирования энтероцитов
Питательная среда для исследования дифференцировки
энтероцитов
Питательная среда для исследования дифференцировки
гладкомышечных клеток
Питательная среда для исследования пролиферации
гладкомышечных клеток
Полужидие среды CloneMedia-HEK и CloneMedia-CHOK1
предлагаются для клонирования cуспензионных клеток
HEK293 и CHOK1 в бессывороточной среде.
48
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

49. Основные стадии технологического процесса

• подготовка компонентов (взвешивание,
смешивание, измельчение);
• растворение;
• стерилизация;
• фасовка, маркировка;
• контроль качества готового препарата.
49
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

50. Стерилизующая фильтрация

50
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

51. Мешки для хранения и транспортировки сред

51
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

52. Показатели качества питательных сред

Для
оценки
качества
и
стандартности
ПС
используют целый ряд физико-химических и
биологических показателей:
показатель концентрации ионов водорода (рН),
содержание ионов хлора, аминного азота,
буферная емкость,
осмоляльность,
прозрачность,
стерильность,
ростстимулирующая активность,
токсичность.
52
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

53. Биологический контроль

Для биологического контроля
используют перевиваемые
гетероплоидные и диплоидные
культуры клеток: L929, HeLa, Hep-2,
ЛЭЧ, Vero. Ростстимулирующую
активность ПС оценивают на
протяжении 4- 5 пассажей. Серия
считается пригодной, если она
обеспечивает формирование сплошного
монослоя клеток типичной морфологии,
не вызывая токсического действия.
Индекс пролиферации должен быть не
ниже,
чем в контрольной среде.
53
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

54. Правила работы со средами и растворами

• Обязательно маркировать все флаконы.
• Фасовать растворы в соответствии с
выполняемыми (планируемыми) объемами
работ.
• Перед использованием растворы и среды
просматривать и согревать до температуры
культивирования.
• Растворы, среды, сыворотки переносить из
сосуда в сосуд с помощью пипетки, не
переливать через край.
54
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

55.

• Инактивировать сыворотку, если это необходимо,
при 560С 30 минут. Затем разлить по 50-100 мл,
заморозить и хранить при температуре
-200С
до использования.
• Не допускать многократного замораживанияоттаивания сыворотки.
• По возможности избегать использования
антибиотиков в работе.
• Соблюдать режимы и сроки хранения
используемых компонентов и растворов. Готовая
среда при хранении в холодильнике при
температуре от 4 до 60С может использоваться в
течении нескольких недель.
55
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

56. ДЛЯ РАЗБАВЛЕНИЯ СПИРТА – ПРАВИЛО КРЕСТА

Зеленый цвет – спирт, голубой - вода
70
мл
960
700
0
26
мл
56

57.

57
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

58.

58
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

59.

• А сыворотку для культивирования,
инактивируют только лишь для инактивации
содержащегося в ней комплемента, поскольку
в любой сыворотке априорно предполагается
наличие антител (гетероантител)способных
реагировать с АГ представленными на
клетках культуры, чтобы предупредить этот
самый антитело-зависимый комплемент опосредованный цитолиз и инактивируют
сыворотку прогреванием при 56 гр. 30-40минут.
59

60. Выполнение аминокислотами той или иной функции во многом зависит от условий культивирования:

• скорость синтеза аминокислот в культуре зависит
от плотности популяции клеток;
• потребность в определенных веществах может
возникнуть в связи с отсутствием каких-либо
сопутствующих метаболитов;
• синтез белка и размножение клеток в культуре
может происходить, если концентрация
незаменимых аминокислот в клетках не ниже 0,01 –
0,04 мМ;
• общая концентрация всех свободных аминокислот в
ПС должна достигать 0,1-0,2 мМ.
60
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

61. ион натрия служит для поддержания осмотического давления в среде; ион калия проникает в клетку и поддерживает внутриклеточное

Неорганические соли.
Макроэлементы:
ион натрия служит для поддержания осмотического
давления в среде;
ион калия проникает в клетку и поддерживает
внутриклеточное осмотическое давление;
ионы кальция и магния входят в состав некоторых
внутриклеточных ферментов и необходимы для роста
клеток на поверхности стекла;
фосфаты участвуют в образовании богатых энергией
макроэнергических фосфатных связей и являются
буферной системой клетки;
ионы бикарбоната играют роль буферных систем в
питательных средах и принимают большое участие в
основных биохимических процессах в клетках.
61
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал

62. BD Biocoat

http://www.bdbiosciences.ca/disc...ID%3D12
4
62

63.

• Сыворотка
• (хранить основной сток при -20 оС, рабочее количество (на
месяц работы) - при +4оС);
• Плохо переносит замораживание-оттаивание, т.к. это вызывает
денатурацию белков.
• Если требуется тепловая инактивация (для инактивации системы
комплемента и предотвращения иммунологической реакции
против культивируемых клеток) перед первым использованием
расплавить и прогреть при 56оС 30' - 1h (вначале прогрева
перемешать несколько раз). Подписать, что сыворотка heat
inactivated (HI), оставить рабочее количество на +4оС, остальное
разаликвотить, быстро заморозить (жидкий азот, сухой лёд) и
хранить при -20оС.
63

64.

64
КУРСЫ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Лекционный материал