Методы анализа живых систем, группы методов

1. ЛЕКЦИЯ №2

Методы анализа живых систем,
группы методов
Хроматографические методы
в анализе живых систем
14.06.2022
ст. преп. Грачева Е.Л.
1

2. Лекция №2

Введение. Литература.
Классификация и суть методов анализа
живых систем.
Особенности анализа живых систем.
Хроматография, общая теория.
Классификация хроматографических
методов анализа
Хроматографические методы очистки
белков.
14.06.2022
2

3. Введение

Данный курс посвящен изучению методов
анализа живых систем (биологических методов
анализа)
В научных биологических исследованиях и в
современной медицинской практике с каждым
годом возрастает роль лабораторной
диагностики.
Химия и биология являются источниками
методических приемов для выявления и
количественного определения компонентов
биологических жидкостей.
14.06.2022
3

4. Литература

Г.А. Урванцева, Е.Л.Грачева.Методы анализа
живых систем: уч. пособие.Яросл. гос. ун-т
им.П.Г. Демидова,-Ярославль:ЯрГУ, 2013.-104 с.
В.С.Камышников.Справочник по клинико-биол.
лаб. диагностике:в 2-х томах.Минск, 2000.- 463 с.
В.Н.Казин,Г.А.Урванцева.Физико-химические
методы исследования в экологии и биологии.
Ярославль,ЯрГУ, 2002.-173 с.
14.06.2022
4

5. Классификация и суть биологических методов анализа

I. Оптические (спектральные методы):
1.Абсорбционная спектроскопия:
а).Измерение светопоглощения,фотометрия ,
УФ-спектроскопия. Используется для изучения
белков, ферментов, нуклеиновых кислот.
б).Измерение окраски и светопропускания
(денситометрия).Используется для изучения
белков и ферментов после электрофореза.
14.06.2022
5

6.

2.Рефрактометрия (измерение показателя
преломления веществ).Например,
определение концентрации белка в
биологической жидкости.
--------------------------------------------------------------II.Электрохимические методы:
1.Электрофорез (на бумаге, ацетате
целлюлозы, в геле (крахмальном, агарозном,
полиакриламидном).Основан на движении
заряженных коллоидных частиц к
противоположно заряженному электроду.
2.Капиллярный электрофорез (более
универсальное применение).
Широко используются в биологической
практике.
14.06.2022
6

7.

Ш.Хроматографические методы анализа- это методы,
основанные на различии скорости переноса веществ
в системе двух фаз, одна из которых подвижна.
Разновидностей метода очень много:
*ТСХ,ВэТСХ,
*ВЭЖХ,
*газовая хроматография,
*эксклюзионная
(гель-проматография),
*аффинная хроматография,
*ионообменная хроматография, высокоэффективная
ионная хроматография
(ВЭИХ)
и др.
Это универсальные методы анализа.Широко применяются в
биологии, химии, медицине.
14.06.2022
7

8.

IV.Гидродинамические методы.
1.центрифугирование.
2.ультрацентрифугирование.
3.вискозиметрия.
V.Метод рентгеноструктурного анализа.
VI.Иммунохимические методы (ИФА,ИХА).
VII.ПЦР и метод молекулярных колоний.
VIII.Метод микроскопии и электронной микроскопии.
IX.Метод меченых атомов.
Х.Резонансные методы (ПМР, ЯМР,ЭПР, ЯГР).
14.06.2022
8

9. Особенности анализа живых систем

Исходный материал (биомасса), из
которого предстоит выделить
интересующее вещество – состоит из
многих сотен или даже тысяч различных
соединений.Разделение таких смесей чрезвычайно сложная процедура.
14.06.2022
9

10.

Работа с биологическими объектами
заключается в необходимости
манипулировать с очень маленькими
количествами вещества: мг, мкг и даже
меньше. Поэтому методы должны быть
высокочувсвительными.
Многие компоненты живых систем обладают
очень низкой устойчивостью.
Задача биолога часто состоит в том, чтобы
выделить то или иное вещество в нативном
состоянии.
Все эти особенности нужно учитывать при
выборе метода исследования биологических
объектов.
14.06.2022
10

11.

Хроматография –
физико-химический метод,
используется для разделения веществ
аналитические цели
14.06.2022
препаративные цели
11

12.

Принцип хроматографического разделения веществ
Молекулы разделяемых веществ
Неподвижная фаза
Подвижная фаза
Эффект разделения основывается на
том, что соединения проходят
расстояние, на котором происходит
разделение, с некоторой, присущей
этому соединению задержкой
Хроматографический процесс состоит из целого ряда
сорбции и десорбции, а также растворения и
элюирования, которые каждый раз приводят к новому
равновесному состоянию
14.06.2022
12

13. Из истории хроматографии

День рождения хроматографии – 21 марта 1903 г.
Доклад М.С. Цвета «О новой категории адсорбционных
явлений и о применении их к биохимическому анализу»
Свой метод М.С. Цвет назвал – «хроматография»
(запись цвета)
Михаил Семёнович Цвет
(1872—1919)
Ричард Кун (институт фундаментальной медицины г. Гейдельберг)
1938г. Нобелевская премия по химии за предложенную Цветом адсорбционную хроматографию
каратиноидов и витаминов):
Альфред Винтерштайн
(1915г. Нобелевская премия по химии за исследования хлорофиллов)
Арчер Портер Мартин, Ричард Лоуренс Миллингтон Синдж
1952г. Нобелевская премия за открытие распределительной хроматографии
Арчер Портер Мартин, Энтони Траффорд Джеймс
(50-е годы - первый газовый хроматограф)
Измаилов, Шрайбер (1938г. Первые работы по тонкослойной хроматографии)
Шталь (1956г. Использование тонкослойной хроматографии как аналитического метода)
14.06.2022
13

14.

Классификация методов хроматографии
По типу агрегатного состояния фаз
Газовая хроматография (ГХ)
Жидкостная
хроматография (ЖХ)
По типу разделения
Адсорбционная
Распределительная
стационарная фаза –
твердая активная основа
Стационарная фаза –
жидкость, нанесенная на твердый
неактивный носитель
Принцип: вещества с разной силой
адсорбируются на твердой фазе
и снова десорбируются
Принцип: в зависимости от
растворимости, вещества
распределяются между двумя
несмешивающимися жидкостями
По технике проведения
Внешняя хроматограмма
вещества детектируются
вне зоны разделения
14.06.2022
Внутренняя хроматограмма
вещества детектируются в зоне разделения
(ТСХ, бумажная хроматография)
14

15.

Классификация методов хроматографии
По форме проведения процесса
Плоскостная
Колоночная
По цели проведения процесса
Аналитическая
Препаративная
Анализ качественного
и количественного состава смесей
Очистка ценных веществ от примесей
Промышленная
Неаналитическая
Исследование физико-химических
характеристик веществ
Выделение чистых веществ
в значительных количествах
По механизму, лежащему в основе
равновеского распределения
Адсорбционная
Распределительная
Ионообменная
Проникающая
Афинная
14.06.2022
15

16.

Колоночная хроматография
стационарная фаза находится в колонке;
прием используется как в газовой, так и в жидкостной хроматографии
Принципиальная схема хроматографа для колоночной хроматографии
Ввод пробы
Разделительная
колонка
Подвижная фаза
в ГХ – газ-носитель
Подвижная фаза
в ЖХ - элюент
Насосная система
Самописец
Хроматограмма
Детектор
Емкость с элюентом
14.06.2022
Сигнал
вещества,
или пик
16

17.

Хроматограмма
Хроматографический пик – концентрация пробы
в подвижной фазе на выходе из колонки как функция времени.
Пик- качественная и количественная характеристика
Качественный анализ: время удерживание одного компонента при
одинаковых условиях хроматографирования – постоянная величина.
Время удерживания – время, которое проходит с момента
введения пробы до регистрации самописцем максимума сигнала.
Условия хроматографии, влияющие на время удерживания:
•тип колонки;
•состав подвижной фазы;
•скорость потока подвижной фазы;
•температура
Количественный анализ: площадь пика
14.06.2022
17

18.

Современные хроматографические методы:
•высокоэффективная жидкостная
хроматография (ВЭЖХ),
•высокоэффективная тонкослойная
хроматография (ВЭТСХ),
•высокоэффективная ионная хроматография
(ВЭИХ),
•сверхкритическая флюидная хроматография
(ВЭИХ),
•капиллярный электрофорез (КЭ)
14.06.2022
18

19. Хроматографические методы очистки белков

Ионообменная хроматография
Хроматография гидрофобных взаимодействий
Гель-проникающая хроматография
Афинная хроматография
--------------------------------------------------------Эти методы подробно рассмотрены в пособии
«Хроматографические методы очистки белков»
14.06.2022
19

20. ВИРТУАЛЬНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

http://phram.ru/ChromLab/
(адрес в Интернете)
[email protected] (e-mail)
OVY123
Раздел оборудование/процесс
(пошаговый) + глоссарий
14.06.2022
(пароль)
20

21. Контрольные вопросы по окончании работы:

Назначение хроматографической
установки Biologic LР?
Что такое ВЭТТ?
Что такое элюирование, элюент, элюат?
Что представляет собой
хроматографический сорбент?
Порядок очистки прибора после анализа?
14.06.2022
21

22.

Расположите стадии
хроматографического процесса
в правильном порядке:
- заливка колонки
- заполнение колонки
- промывка системы
- режим эксплуатации
- подключение колонки
- очистка системы
- определение ВЭТТ колонки
14.06.2022
22