Генетика мікроорганізмів. Мінливість бактерій. Мікробіологічні основи генної інженерії і біотехнології

1.

Генетика мікроорганізмів.
Мінливість бактерій.
Мікробіологічні основи
генної інженерії і
біотехнології.
ВНМУ ім. М.І.Пирогова
Кафедра мікробіології

2. Організація генетичного апарату бактерій

Геном - вся сукупність генів у
бактеріальній клітині.
Ген
– це фрагмент молекули ДНК,
що кодує послідовність
амінокислот в поліпептидному
ланцюзі, яким обумовлюється
певна ознака окремої особини

3.

Генотип
- індивідуальні
спадкові властивості і ознаки
мікроорганізму, зумовлені
індивідуальним геномом
Фенотип
– це зовнішні прояви
результату взаємодії бактерії із
оточуючим середовищем, які
знаходяться під контролем
генотипу
(індивідуальний прояв генотипу)

4. Особливості генетики бактерій

Геном бактерій складається із
хромосоми і позахромосомних
елементів
Хромосома
бактерій представлена
кільцевою молекулою ДНК, що
містить від 400 до 4000 генів
(виключення –B.burgdorferi, хромосома
якої є лінійною)

5. Особливості генетики бактерій

Хромосома бактерій знаходиться у
цитоплазмі у вільному стані, в суперспіралізованій формі
Бактерії є гаплоїдними організмами, але
вміст ДНК в клітині в певних станах може
досягати кількості 2,4 або 8 хромосом
Передача генетичної інформації у бактерій
здійснюється як по вертикалі (дочірнім
клітинам), так і по горизонталі (в процесі
генетичних рекомбінацій)
Досить часто бактерії мають
позахромосомний плазмідний геном, який
надає їм важливих біологічних властивостей

6. Позахромосомний генетичний матеріал бактерій

Плазміди – кільцеві молекули ДНК, які
містять до 40 генів, і стабільно спадкуються
клітиною в позахромосомному стані
Транспозони- дрібні, не здатні до
самовідтворення позахромосомні молекули
ДНК, які містять від 4 до 10 генів
Вставні послідовності (IS-елементи) – короткі
ланцюги ДНК, які самостійно не реплікуються
і не кодують фенотипових ознак, але здатні
регулювати активність генів хромосоми,
вільно пересуваючись з однієї її ділянки до
іншої

7. Класифікація плазмід

В залежності від місця
розташування:
Автономні
– не пов’язані з хромосомою
кільцеві молекули ДНК, що самостійно
реплікуються в цитоплазмі бактерій.
Інтегровані- вбудовані у хромосому і
реплікуються разом з хромосомою.

8. Класифікація плазмід

В залежності від шляхів поширення
від однієї клітини до іншої
Трансмисівні
( R- і F-плазміди )передаються шляхом кон’югації.
Нетрансмісивні – знаходяться у великій
кількості в клітини (до 30), що
забезпечує їх довільний розподіл у
дочірних клітинах.

9. Класифікація плазмід

За біологічними властивостями, що
кодуються:
R-плазміди (від англ. resistance – стійкість) –
містять r-гени і RTF-фактор, які
зумовлюють резистентність бактерій до
протимікробних препаратів і здатність до
передачі в процесі кон’югації
F-плазміди
і Hfr-фактори (від англ.fertility-
родючість, high frequency of recombination- висока частота
рекомбінацій) –
кодують синтез спеціальних
F-пілей, необхідних для кон‘югації,
зумовлюють прискорений поділ бактерій.

10. Класифікація плазмід

плазміди – плазміди, що кодують
синтез біологічно активних сполук
(бактеріоцинів), відповідальних за явище
мікробного антагонізму між спорідненими
видами
Tox- плазміди – плазміди патогенності, які
містять tox-гени, що надають бактерії
здатності синтезувати токсини
Ent – плазміди- плазміди патогенності, що
зумовлюють синтез ентеротоксину
Col-

11. Класифікація плазмід

плазміди – містять гени, які
кодують синтез мембранотропних
токсинів (гемолізинів)
Плазміди біодеградації – надають
бактеріальній клітині властивостей
синтезувати ферменти, що
розщеплюють природні і синтетичні
сполуки, і використовувати їх як
джерело енергії або пластичного
матеріалу
Криптогенні плазміди – роль цих
плазмід у життєдіяльності бактерій не
з‘ясована
Hly–

12. Функції плазмід

Регуляторна функція – плазміди
компенсують дефекти метаболізму
бактерій шляхом вбудовування в
ушкоджений геном
Кодуюча функція –внесення в
мікробну клітину нової генетичної
інформації, яка зумовлює появу
нових біологічних властивостей, що
сприяє виживанню бактерій у
змінених умовах середовища

13. Мінливість бактерій

Фенотипова
(модифікаційна)
мінливість або модифікації
виникає під впливом факторів
зовнішнього середовища і не
супроводжується змінами у
генетичному апараті
Генотипова мінливість (мутації і
генетичні рекомбінації) зумовлена
змінами у генетичному апараті
бактерій

14. Види модифікацій

Морфологічні модифікації
Приклад: поява нестабільних L-форм під впливом
пеніцилінів; виникнення інволюційних форм
бактерій у старих культурах.
Біохімічні модифікації
Приклад: синтез індуктивних ферментів за умови
наявності відповідного субстрату в середовищі
Дисоціація форма внутрішньопопуляційної мінливості, яка проявляється
появою особин, що відрізняються від
початкового типу культуральними,
біохімічними, морфологічними та
антигенними ознаками

15. Характеристика дисоциатівних форм бактерій

Ознаки
Характеристи
ка колоній
Біохімічні
властивості
S-форма
R-форма
Опуклі, з рівним
Плоскі або із зміненим
краєм і гладенькою рельєфом, нерівний
поверхнею
край, змінена
структура
Типові для виду
Змінені, не типові для
виду
Антигенна
структура
Типовий для виду
соматичний Оантиген
Вірулентність висока
Змінений
(деградований)
соматичний R-антиген
Низька (викл. збудники
сибірки, чуми, дифтерії,
туберкульозу)
Чутливість до висока
антибіотиків
низька

16. Генотипова мінливість

Мутації – зміни в первинній структурі
ДНК клітини, які супроводжуються
стійкою стрибкоподібною зміною
певної біологічної ознаки і стабільно
успадковуються наступними
поколіннями
Генетичні рекомбінації – зміни в
генотипі бактерій, які зумовлені
передачею фрагменту геному однієї
клітини (донор) до іншої (реципієнт), і
супроводжуються появою нових
ознак у рекомбінанта

17. Класифікація мутацій

Спонтанні мутації зумовлені дією
ендогенних чинників :
помилки ферментів в процесі реплікації
ДНК
взаємодія хромосомної ДНК з
позахромосомними елементами
(транспозонами, IS-елементами)
частота виникнення - 10 -7 -10-9
Індуковані мутації виникають під впливом
направленої дії на геном бактерій
екзогенних чинників або мутагенів
частота виникнення – 10-4 – 10-5

18. Класифікація мутагенів

Фізичні мутагени:
Іонізуюче випромінювання сприяє
утворенню димерів пиримідину, що
ускладнює процес розподілу ДНК
на 2 нитки і призводить до обриву
ДНК в процесі реплікації
Ультрафіолетове випромінювання
викликає утворення димерів
тиміну, що зумовлює помилки в
генетичному коді при реплікації
ДНК

19. Класифікація мутагенів

Хімічні мутагени:
Аналоги азотистих основ (напр.,
бромурацил) включаються в молекулу ДНК замість
подібної за структурою азотистої основи і при
реплікації зумовлюють вставку невідповідної
основи
Алкілуючі
речовини (напр.,
етілметансульфонат) викликають модифікацію
азотистих основ
Нітрозосполуки
і азотиста кислота
дезамінують азотисті основи
Акридинові
барвники вбудовуються між
азотистими основами, що призводить до втрати
нуклеотидів або вставки додаткової пари в процесі
реплікації

20. Класифікація мутацій за величиною ділянки ДНК, що зазнала змін:

Точкові мутації виникають в межах одного
Лінійні (генні) мутації - це зміни ДНК в межах
Геномні мутації пов‘язані з змінами одного або
триплету:
делеція
вставка
модифікація
гену
Делеція
дуплікація
інверсія
Транслокація
декількох генів

21. Класифікація мутацій за фенотиповими наслідками:

Летальні
Умовно-летальні
Нейтральні
Класифікація мутацій за місцем
виникнення:
Хромосомні
Позахромосомні

22. Генетичні рекомбінації

Генетичні рекомбінації – це обмін
генетичною інформацією між двома
спорідненими бактеріальними
геномами
Види рекомбінацій:
1. Трансформація
2. Кон'югація
3. Трансдукція

23. Трансформація

Трансформація це процес включення у
геном клітини реципієнту поглинутих
фрагментів донорської ДНК (хромосомної або плазмідної)
Умови для здійснення:
компетентність реципієнту
гомологічність донорської ДНК (близька
генетична спорідненість донора і реципієнта)
наявність двохниткового фрагменту ДНК
велика молекулярна маса фрагменту ДНК

24. Стадії трансформації

1.
2.
3.
4.
5.
6.
Адсорбція ДНК на клітині
реципієнта
Фрагментація донорської
ДНК клітинними
ендонуклеазами
Проникнення фрагментів
ДНК у цитоплазму
реципієнта
Руйнація одної нитки ДНК
Рекомбінація
однониткових фрагментів
ДНК з ДНК реципієнта
Утворення рекомбінанта

25. Кон'югація

Кон’югація – процес обміну
генетичним матеріалом при
безпосередньому контакті клітини
донора (F+ або Hfr+) і реципієнта
Умови для здійснення:
наявність у клітини донора Fплазміди або Hfr-фактора
як правило, спорідненість
генотипу донора і реципієнта

26.

Умови для здійснення (продовження):
наявність
позахромосомних
генетичних
елементів, які
передаються від
донора до
реципієнта

27. Трансдукція

Трансдукція – процес передачі
фрагментів ДНК донора до
клітини реципієнта за допомогою
бактеріофагів
Види :
специфічна
неспецифічна
абортивна
Необхідною умовою для здійснення
трансдукції є наявність
бактеріофагів, які перед тим, як
інфікувати клітину-реципієнт,
репродукувались в донорській
клітині

28. Види трансдукції

Неспецифічна виникає внаслідок передачі
будь-якої ділянки ДНК донора, випадково
включеної в голівку бактеріофагу
Специфічна зумовлена передачею певних
ділянок ДНК донора за допомогою
помірних дефектних фагів
Абортивна – варіант специфічної
трансдукції, коли ДНК дефектного фагу не
вбудовується в ДНК реципієнта, а вільно
розташовується в цитоплазмі

29. Інші види рекомбінацій

Трансфекція – варіант трансформації
бактеріальних клітин без клітинної стінки
за участю вірусної (фагової) ДНК.
В генній інженерії трансфекцією також
називають введення будь-якої чужорідної
ДНК в клітини еукаріотів і прокаріотів
Сексдукція – перенесення генетичного
матеріалу від донора до реципієнта за
допомогою F`-плазміди
F`-плазміда – це попередньо інтегрована у
хромосому бактерій F-плазміда, яка під
час вирізання із хромосоми випадково
може захопити від одного до кількох генів
із бактеріальної хромомсоми

30. Генетика вірусів

Особливості вірусного геному:
1. Містить тільки один тип нуклеїнової кислоти
(ДНК або РНК)
2. Гаплоїдність, що зумовлює негайне
потрапляння мутантів під контроль
природного відбору (диплоїдний геном
мають тільки ретровіруси і реовіруси)
3. Мала ємкість геному (від 3 до 200 генів).
4. Існування різних механізмів підвищення
ємкості вірусного геному (перекривання
геному, наявність декількох рамок
зчитування, сегментація та інше)

31.

Генофонд вірусних популяцій поповнюється і
змінюється внаслідок:
1. Мутацій (напр., антигенний дрейф у вірусів
грипу)
2. Рекомбінацій між спорідненими РНК
вірусами із сегментованим геномами (напр.,
антигенний шифт у вірусів грипу)
3. Рекомбінацій в межах геному двохниткових
ДНК вірусів
4. Рекомбінацій з геномом клітини хазяїна
(можливо для онкогенних вірусів, які
вбудовують власний геном у геном
інфікованої клітини)

32. Фенотипові прояви вірусних мутацій

Зміна чутливості вірусів до температури
Зміна чутливості до противірусних
хімічних агентів
Зміна вірулентності
Поява здатності розмножуватись в інших
клітинах (зміни в рецепторному апараті
вірусу)
Зміни в швидкості репродукції в
інфікованих клітинах
Зміна типу взаємодії вірусу з клітиною
хазяїна
Зміна антигенної структури

33. Генетичні рекомбінації у вірусів

Здійснюються за наступними механізмами:
1. Перехрещення (кросінговер) – у ДНК вірусів
в результаті кросінговеру двох дефектних
геномів може з’явитись один повноцінний
2. Транскрипція “у вигляді стрибка” при
копіюванні однієї нитки РНК РНК-полімераза
може “перестрибнути” на іншу нитку і
продовжити процес транскрипції
Обидва шляхи ведуть до відновлення
повноцінного геному, що має назву
генетична реактивація або перехресна
реактивність

34. Генетичні рекомбінації у вірусів

Транслокація – обмін окремими
сегментами геному між спорідненими
вірусами при одночасному знаходженні
в інфікованій клітині (антигенний шифт)
2. Інсерція з наступною делецією
відбувається при інфікуванні клітини
вірусами, які здатні вбудовувати свій
геном у геном хазяїна (інсерція). При
вирізанні вірусного геному (делеція)
випадково можуть захоплюватись
ділянки ДНК хазяїна
Останні 2 механізми рекомбінації відбуваються між різними геномами
1.

35. Вірусні модифікації

Неспадкова мінливість вірусів пов’язана із
змінами його оболонки
1. Фенотипове змішування виникає
внаслідок одночасної репродукції двох
різних вірусів в клітині і зумовлене
вбудовуванням компонентів оболонки
одного вірусу в оболонку іншого
2. Фенотипове маскування може
відбуватись при одночасному
морфогенезі двох різних вірусів в
інфікованій клітині, коли геном одного
вірусу потрапляє в оболонку іншого

36. Негенетичні види взаємодії вірусів

Комплементація – функціональна
кооперативна взаємодія вірусів з
дефектами у різних генах, при якій
функцію ушкодженого гену одного
вірусу бере на себе неушкоджений ген
іншого
Таким чином, це уможливлює репродукцію обох вірусів,
при неможливості розмножуватись окремо
Види комплементації:
1.
2.
Двостороння (обидва віруси дефектні)
Одностороння (тільки один вірус має
ушкоджений геном)

37. Негенетичні види взаємодії вірусів

Інтерференція – неможливість
проникнення і розмноження вірусів у
клітині, яка вже інфікована іншим
вірусом
Види інтерференції:
Гомологічна
Гетерологічна

38. Механізми інтерференції

1.
2.
3.
4.
5.
Інфікована клітина вивільняє
інтерферон, який стимулює синтез
рибонуклеази і протеінази, що
унеможливлює подальшу репродукцію
вірусу
На інфікованій клітині блокуються або
руйнуються рецептори, до яких може
приєднатись інший вірус
Інактивація білків, які зв’язуються з
геномом вірусу (блок трансляції)
Блокування утворення мРНК
Більш швидка реплікація одного вірусу
викликає блокаду клітинних ферментів,
необхідних для реплікації іншого

39. Практичне застосування молекулярної генетики бактерій

1.
2.
3.
Вивчення організації геномів і
створення хромосомних карт
бактерій, що є основою філогенетичної класифікації мікроорганізмів
Отримання рекомбінантних молекул
ДНК з метою створення клітин із
необхідними властивостями
Клонування рекомбінантних ДНК у
векторних системах (плазмідах,
вірусах

40. Практичне застосування молекулярної генетики бактерій

4. Визначення генетичних кодів для певних
білків за допомогою секвенування ДНК
5. Створення високо специфічних ДНК і РНКзондів для виявлення нуклеїнових кислот
збудника у матеріалі шляхом гібридизації з
міченими зондами (southern-blot і northernblot)
6. Діагностика інфекційних захворювань за
допомогою полімеразної ланцюгової реакції
(ПЛР), яка дозволяє підвищити кількість
копій досліджуваної ДНК у 106-108 разів, і ,
відповідно, підвищити інформативність
методів молекулярно-генетичної
діагностики

41. Генна інженерія

Генна інженерія – сукупність
експериментальних методів
перенесення генетичного матеріалу з
однієї клітини в іншу з метою
конструювання молекул ДНК з
заданою комбінацією генів і
створення біологічних об'єктів з
корисними властивостями

42. Етапи генно-інженерних досліджень

1.
Вибір і вилучення із
організму клітиндонорів, що мають
корисні властивості,
генетичного
матеріалу.
2. Фрагментація отриманої
ДНК з метою одержання
окремих комбінацій генів

43. Етапи генно-інженерних досліджень

3. Введення отриманих
фрагментів у вектори
(плазміди або
бактеріофаги)
4. Введення векторів з
рекомбінантною ДНК в
клітини мікроорганізмів
(трансформація або
трансфекція)

44. Етапи генно-інженерних досліджень

5.Аналіз мікробної популяції і
виділення штаму рекомбінанта
6.Експлуатація одержаного штаму
продуцента:
- мікробіологічний синтез
корисних речовин;
- клонуванння рекомбінантних
генів для їх наступного закріплення у
обраному геномі

45. Біотехнологія

Біотехнологія- наука, яка вивчає
промислові процеси, в яких
використовують мікроорганізми,
біокаталізатори і різні біологічні
системи з метою отримання
корисних для людей кінцевих
продуктів

46. Етапи біотехнологічного процесу

1.
2.
3.
4.
5.
Вибір природного штаму мікроорганізмупродуценту або штучне його створення
Вирощування штаму-продуценту і
біосинтез необхідного продукту
Виділення і очищення необхідної
речовини із культурального середовища
або клітинної маси
Стадія контролю готової продукції
Стадія отримання готової продукції

47. Лікарські препарати - продукти мікробного синтезу

1.
2.
3.
4.
Амінокислоти: лізин, триптофан,
глютамінова кислота та ін.
Вітаміни: групи В (В1, В2, В6, В9,В12),
аскорбінова кислота
Антибіотики : пеніциліни,
цефалоспорини, аміноглікозиди,
макроліди, тетрацикліни та ін.
Людські гормони: інсулін, еритропоетин,
соматотропний гормон

48. Лікарські препарати - продукти мікробного синтезу

5. Бактеріальні ферменти: L-аспаргіназа;
стрептокіназа і целіаза; солізим і сомілаза;
терилітин і аспераза
6. Інтерферони: реальдирен, роферон,
реаферон ( ), бетафор,ребіф ( ); імукін ( )
7. Інтерлейкіни: ронколейкін; філграстим
(нейпоген); ленограстим (граноцит 34);
молграмостим (лейкомакс)

49. Лікарські препарати - продукти мікробного синтезу

8. Антигени мікроорганізмів і вірусів :
антигени ВІЛ, вірусу гепатиту В
9. Вакцинні препарати: рекомбінантні і
векторні вакцини, ДНК-вакцини,
трансгенні рослинні вакцини