Характеристические профили стероидных гормонов и аминокислот, полученные методами ВЭЖХ и ВЭТСХ

1.

Характеристические профили
стероидных гормонов и аминокислот,
полученные методами ВЭЖХ и ВЭТСХ
Кулькова Валерия
АГ СПбГУ, 11 кл.
Научный руководитель:
проф. СПбГУ, д.х.н. К…… Анна Алексеевна
г. Санкт-Петербург
2013 год

2.

Краткая характеристика стероидов
Стероидные гормоны - биологически активные
вещества, вырабатываемые железами внутренней
секреции. Обладают строго избирательным
действием противовоспалительным и
антиаллергическим
21
20
12
22
24
26
25
18
23
17
19
11
1
9
2
3
10
A
5
4
C
8
B
13
D
14
16
27
15
7
6
2

3.

Заболевания, связанные с нарушением
работы эндокринной системы
Причины заболеваний:
нарушения в биосинтезе
гиперпродуцирование гормонов
недостаточное продуцирование
гормонов
Болезнь Иценко-Кушинга
(БИК)
Синдром Иценко-Кушинга
(СИК)
Первичный
гиперальдостеронизм
(ПГА)
3

4.

Традиционные методы диагностики
1) ИФА. Анализ содержания
кортизола в сыворотке крови и
моче
Диагностика –
длительная, и часто
дорогостоящая
процедура
2) Дексаметазоновая проба
3) Данные ультразвукового
исследования, КТ, МРТ
Разработка метода
экспресс-диагностики
4

5.

Структурные формулы кортикостероидов
и стероидных лекарственных средств
Экзогенные стероидные
лекарственные препараты
Эндогенные кортикостероиды
HOH2C
HOH2C
CH3
CH3
HO
O
OH
H
CH3
OH
OH
H
CH3
H
H
O
O
O
CH3
Преднизолон
H
H
CH3
HO
OH
H
H
H
O
O
O
O
Кортизол
HOH2C
HOH2C
O
Кортизон
O
CH3
CH3
H
CH3
H
CH3
OH
CH3
O
O
H
H
CH3
O
Кортизон
ацетат
HO
O
O
O
CH3
H
H
OH
O
O
Кортикостерон
11-дегидрокортикостерон
CH3
OH
CH3
F
H
O
O
CH3
CH3
O
O
OH
CH3
H
CH3
H
H
Дексаметазон
HOH2C
HOH2C
H
CH3
CH3
HO
O
Кортинефф
CH3
H
OH
F
H
O
O
11-дезоксикортикостерон 11-дезоксикортизол
O
5
OH

6.

Цель работы
Оптимизировать хроматографические
(ВЭТСХ и ВЭЖХ) условия разделения и
пробоподготовки стероидных гормонов,
провести хемометрическую обработку с
целью получения дополнительных
диагностических критериев
эндокринных патологий
6

7.

Задачи
1. Оптимизация условий разделения стероидных гормонов с
использованием методов ВЭТСХ и высокоэффективной
жидкостной хроматографии с УФ-детектированием.
2. Определить пределы обнаружения аналитов.
3. Разработка процедуры пробоподготовки.
4. Выявление возможности получения характеристических
профилей.
7

8.

Подвижная
Насосная
фаза
система
инжектор
колонка
Блок-схема
жидкостного
хроматографа
Детектор
Персональный
компьютер
8

9.

б)
в)
а)
H
H
HO
H
H
H O
O
OH O
H
OHO
HO
H
H
H
OH
H
H
OH
O
H
H
H
H
H
OH
H
O
O
HO
H
H
H
OH
H
HO
H
O
H
HO
OH
O
HO
H
H
H
OH
O HO
H
HO H
15 мМ ДДСН
H
OH O
HO
H
H
O
H
OH O
HO
H
OH
H
O
H
8 мМ β-ЦД
Хроматограмма
(E), кортикостерона (В), 11-дегидродексаметазон смеси кортизола (F), кортизона
11-дегидрокортикостерон
кортикостерона (А), преднизолона
(Pl), дексаметазона(DEX),
кортизон ацетата (E-ac) и
Предел обнаружения
3 – 5 мкг/л
кортинеффа (Cort) (10 мкг/мл). Хроматограф HPP 4001 (Чехия), УФ-детектор (254нм),
колонка «Supelco» 150*4,6 мм (3 мкм)
9

10.

Комплексообразование циклодекстринов
(ЦД) со стероидными гормонами
HOH2C
O
OH
OH
HO
H 3C
H 3C
O
β-ЦД:
Растворимость: 1,85 г/100 мл (25º ),
Объем полости: 0,346 нм³,
Внутренний диаметр полости: 0,60-0,65 нм,
рКа: 12,20
10

11.

кортизон
35.0
32.5
30.0
27.5
25.0
22.5
д
е
к
с
а
м
е
т
а
з
о
н
20.0
17.5
15.0
12.5
11-дезоксикортизол
п
р
е
д
н
и
з
о
л
о
н
37.5
11-дезоксикортикостерон
40.0
кортикостерон
кортизол
mAU
42.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
мин
Хроматограмма смеси стандартов гидрофобных лекарств и эндогенных
гормонов («Shimadzu»). Подвижная фаза: ацетонитрил-вода, градиентный
режим. Детектор УФ, 254 нм. Скорость потока: 300 мкл/мин. Объем
11
пробы: 20 мкл.

12.

ВЭТСХ
Достоинства
mAU
• экспрессность
• одновременное
определение
образцов
• количественный
анализ
12

13.

Количественная обработка данных (ТСХ)
Яркость
F
E
B
DOC
S
Dex
Линейная (F)
Линейная (E)
Линейная (B)
Линейная (DOC)
Линейная (S)
Линейная (Dex)
2500
2000
1500
1000
500
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
мкг
Количественная обработка
экспериментальных данных в ВЭТСХ
методом видиоденситометрии с
использованием программы Sorbfill TLC.
1,6
13

14.

Используемые материалы
Purosep 270
С18
(сверхсшитый
полистирол)
Гидрофобные
соединения
Силикагель
Гидрофильные
соединения
H2
C
Sуд=1500 м²/г,
плотность=0,7
г/см³ dпор =200Å
H2C
CH2
Фрагмент структуры
сверхсшитого полистирола
14

15.

Твердофазная экстракция (ТФЭ)
Схема твердофазной экстракции
Purosep 270
EtOH
0,1 н NaOH
20% CH3CN
40%EtOH
СH2Cl2
MeOH/
2:1
15

16.

Стероидный гормон
Преднизолон
Кортизон ацетат
Дексаметазон
Кортинефф
Кортизол
Кортизон
Кортикостерон
11-дезоксикортикостерон
11-дезоксикортизол
Степень извлечения (%)
Сыворотка крови
Моча
Хлороформ
Хлороформ Дихлорметан
72,3±2,3
65,4±2,1
55,6±1,4
54,3±1,2
81,0±4,3
78,6±2,6
54,0±1,5
50,0±2,3
47,0±4,0
80,3±1,5
79,5±2,5
64±4
62±3
82,3±2,5
80,6±1,8
72,6±2,5
65,8±1,5
64,4±1,9
Степень извлечения = (Sx-S)/ S0 * 100%,
где Sx – площадь хроматографического пика
аналита после экстракции объекта со стандартной добавкой;
S0 – площадь хроматографического пика аналита
до экстракции водного раствора стандарта;
S - площадь хроматографического пика аналита после
экстракции биологического объекта;
85,3±2,6
93,2±1,8
79,6±2,7
80,2±2,5
102,8±3,5
93,7±2,5
70,0±3,0
71,0±3,0
65,5±1,9
16

17.

Метод главных компонент (МГК)
ti1ti2 – cчет образца
График счетов
17

18.

График счетов
Виден четко
сформированный
кластер норм.
Имеется размытый
кластер образцов с
синдромом
Иценко-Кушинга.
18

19.

Альфа-аминокислоты, не поглощающиеся в УФ

20.

Введение хромофорных групп дериватизация
4-фтор-7-нитробензо-1,2,3-оксадиазол (I), предел обнаружения 5 – 20 пмоль
SCH2CH2OH
CHO
CH2CH2OH
CHO
RNH2
NR
SH
о–фталевый альдегид (ОФА)(II)
в присутствии тиольной компоненты 2-меркаптоэтанол; λвозб/λизл = 337/454 нм
диметиламиноазобензосульфонилхлорид (дабсилхлорид) (III)

21.

Выводы
1. Оптимизированы условия разделения стероидных гормонов
методом ВЭЖХ с УФ-детектированием с использованием в
составе подвижной фазы β-циклодекстрина.
2. Определены пределы обнаружения аналитов.
3. Разработана процедура пробоподготовки мочи к
хроматографическому анализу.
4. Выявлена возможность получения характеристических
стероидных профилей для диагностики эндокринных
патологий.
19

22.

Спасибо за внимание!
22

23.

Параметры удерживания в ВЭТСХ
Rf = Zm/Zr,
где Zm – расстояние, пройденное веществом от
стартовой линии до центра пятна (мм);
Zr – расстояние, пройденное элюентом от
стартовой линии до фронта (мм).
Селективность
α=(КА/Кв)-1,
где КА, Кв – константы распределения аналитов
между подвижной и неподвижной фазами.
Эффективность
N = 16-(zi /w)2,
где w – ширина пятна, zf – путь, пройденный
аналитом.
23

24.

Дексаметазон
Преднизолон
O
O
CH3
CH3
HO
OH
CH3
H
F
O
OH
HO
CH3
CH3
OH
OH
H
H
H
O
24

25.

H = nH – 4√(nf),
где nH – суммарное число атомов
углерода и галогенов,
nf – число функциональных групп в
молекуле сорбата;
25

26.

Хроматография
газ
Газовая
жидкость
флюид
Сверхкритическая
флюидная
Жидкостная
адсорбционная
распределительная
гель-хроматография
ионообменная
аффинная
7

27.

3
1
2
t R1
t R2
9

28.

Анализ методом (ВЭТСХ)
28

29.

Общая схема анализа биологических образцов
методом ВЭТСХ
Концентрирование и очистка пробы
Анализ методом ВЭТСХ
Количественная обработка
полученных данных методом
видеоденситометрии

30.

Аналит + комплексообразователь
комплекс
HO
R
H
C
-
O
COOH
O
O
Изменение
N
селективности
H
H
разделения
и
H
O
эффективности
O
Обнаружение аналитов, не
поглощающих вHУФ
2N
N
N
N
O
O
Cu
N
O
NH2
O
O
O
O
Снижение пределов
обнаружения
O-
O
OH
OH
Cu
HO
OH
OH
O
O
O
H
H
O
O
H
OH
O
O
Cu
30
O

31.

Влияние размера циклодекстрина на процесс
комплексообразования
α
H
H
HO
H
H
OH O
O
H
OH
H
H
H
H
HO
H
H
O
H
OHO
H
H
HO
H
H
OH HO
O
O H
OHH
OH
H
O
H
4,7 – 5,2 Ǻ
H
H
OH
O
H
HO
H
H
OH O
HO
H
H
H
OH
а
н
а
л
и
т
ы
β
H O
O
OHO
OH
HO
HO
H
H
H
H
OH O
H
H
OH
H
O
H
H
H
H
OH O
HO
H
OH
6,0 - 6,6 Ǻ
OH
O
HO
H
H
H
H
H
H
H
OH
O HO
H
HO H
H
H
O
H
OH O
H
HO
H
OH
H
H
O
OHO
OH
O
H
H
O
HO
H
HO
H
OH
H
OH
H
H
OH
H
O
H
H
HO
H
H
O
OH
H
HO
H
HO
O
H
H O
O
H
OHO
γ
HO
H
H O
H
O H
H
OH O
OH
HO
H
H
H
O
7,5 – 8,4 Ǻ
H
HO
H
H
HO H
H
O
H
H
OH
HO
OH
O
O
OH
H
H
OH
O
H
HO
H
O H
H
OH
H
OH
O HO
H
O
HO
OHO
H
H
OH
H
H
H
O
H
H
O
H
H
Анестетики (мепивакаин,
Аминокислоты
Производные аминокислот,
небольшого размера прилокаин), нестероидные
варфарин, стероиды
противовоспалительные
(фенилаланин,
(кортикостерон)
триптофан, тирозин)
препараты (флобуфен, ибупрофен)
HOH2C
HO
O
CH3
HO
O
CH3
O
H
OH
NH2
O
31