2.51M
Category: biologybiology

Экпрессия белков, регулирующих прохождение фазы G1 клеточного цикла,

1.

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «СанктПетербургский государственный Химико-фармацевтический Университет» Министерства здравоохранения
Российской Федерации
ЭКПРЕССИЯ БЕЛКОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ
ПРОХОЖДЕНИЕ ФАЗЫ G1 КЛЕТОЧНОГО
ЦИКЛА, В КЛЕТКАХ АДЕНОКАРЦИНОМЫ
КИШЕЧНИКА НСТ116 И H5
Работа выполнена в лаборатории
внутриклеточной сигнализации
ФГБУН НИЦ РАН
Руководитель отдела и лаборатории, д.б.н.,
профессор Никольский Николай Николаевич
Научный руководитель:
к.б.н., доц. Арсениев Николай Анатольевич
Научный руководитель:
д.б.н., в.н.с. Попов Борис Валентинович
г. Санкт-Петербург
2021г.
1

2.

Общая схема прохождения клеткой фазы G1
2

3.

a
M
G2/M
Cell cycle
S
G1
After G0/G1 transition Cdc25A is
ubiquitylated and degraded in proteasomes
R1
Cdc25A removes inhibitor phosphates
from Cdk2 and promotes G1/S transition
Cyclin E
Cdc25A
Cdk2
P P
Degradation in
proteasomes
Cdc25A
Fbw7
b
?
Cdc25A
Usp28
i
Deubiquitination
Cdc25A
Fbw7
Active proliferation
of НСТ116 cells
Cdc25A
Cdc25A
Usp28
ii
Fbw7
Cdc25A
Degradation in
proteasomes
Inhibition of proliferation
of Н5 cells
Попов Б., Пeтрова Е., Рябов В. «Уровень Cdc25A, формирующей контрольную точку R1, стабилизируется в клетках
аденокарциномы кишечника HCT116 деубиквитиназой Usp28»
3

4.

Целью данной работы было изучение роли белков Usp28, Cyclin E,
Cyclin D1, Cdk4, Cdk2 и E2F1 в развитии аденокарциномы кишечника
человека на клетках линии -HCT116 и с ингибированной деубиквитиназой
– H5
Задачи:
• С помощью иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) определить
изменение экспрессии Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4, Usp28 и E2F1 в ходе
клеточного цикла в As и 12h точке
• С помощью иммуноблотинга определить изменение уровней Usp28,
Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4, Cdk2 и E2F1 в ходе клеточного цикла
• Охарактеризовать по уровню продукции в клетках Usp28 возможную
взаимосвязь между Usp28 и Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4 , Cdk2 и E2F1
4

5.

Иммунофлюоресцентная оценка экспрессии исследуемых белков в клетках HCT116 и Н5 в
As точке
HCT116 - G1/S - As
E2F1
Cdk4
Cyclin E
Usp28
Cyclin E
Usp28
Cпецифические
антитела
Совмещенные
изображения
(специфические
антитела+DAPI
Cyclin D1
H5 - G1/S - As
E2F1
Cdk4
Cпецифические
антитела
Совмещенные
изображения
(специфические
антитела+DAPI
Cyclin D1
Рис.1. Экспрессия белков Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4 и E2F1 в HCT116 и H5 клетках в As точке по данным ИФА

6.

Иммунофлюоресцентная оценка экспрессии исследуемых белков в клетках HCT116 и Н5 в
точке G1/S
HCT116 - G1/S - 12h
E2F1
Cdk4
Cyclin E
Usp28
Cyclin E
Usp28
Cпецифические
антитела
Совмещенные
изображения
(специфические
антитела+DAPI
Cyclin D1
H5 - G1/S - 12h
E2F1
Cdk4
Cпецифические
антитела
Совмещенные
изображения
(специфические
антитела+DAPI
Cyclin D1
Рис.2. Экспрессия белков Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4 и E2F1 в HCT116 и H5 клетках в 12h точке по данным ИФА

7.

Оценка продукции исследуемых белков в клетках H5 с помощью иммуноблота
Рис.3 Иммуноблот продукции Usp28, Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4 и E2F1 в клетках H5 в As точке
7

8.

Оценка продукции исследуемых белков в клетках HCT116 и H5 с помощью иммуноблота
(а)
(б)
Электрофоретические полосы белка E2F1
в HCT116 и H5
3
Название оси
2,5
Hct 116 As
Hct 116 12h
2
H5 As
1,5
H5 12h
Hct 116 As
1
Hct116 12h
0,5
H5 As
H5 12h
0
Hct 116 Hct 116 H5 As
As
12h
H5 12h Hct 116 Hct116
As
12h
H5 As
H5 12h
Рис.4 а- Иммуноблот продукции E2F1 в клетках H5 и HCT116, б- графическое представление
экспрессии Usp28, CycE, cdk2 в клетках H5 и HCT116 по данным вестерн-блота
8

9.

Оценка продукции исследуемых белков в клетках HCT116 и H5 с помощью иммуноблота
(а)
(б)
Содержание белков относительно актина
Электрофоретические полосы белков Usp28,
CycE, cdk2 в HCT116 и H5
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Hct 116 As USP28
Hct 116 12h USP28
H5 As USP28
H5 12h USP28
Hct 116 As Cyc E
Hct116 12h Cyc E
H5 As Cyc E
H5 12h Cyc E
Hct 116 As cdk2
Hct 116 12h cdk2
Рис.5 a- Иммуноблот продукции Usp28, CycE, cdk2 в клетках H5 и HCT116, б- графическое
представление экспрессии Usp28, CycE, cdk2 в клетках H5 и HCT116 по данным вестерн-блота
9

10.

Выводы:
1) По результатам ИФА экспрессия исследуемых белков ярко выражена в
клетках HCT116.
2) По результатам WB в клетках с ингибированной деубиквитиназой
Usp28, продукция исследуемых белков выражена слабо, по сравнению с
материнской линией.
3) Наблюдается прямая зависимость между изменением количества
экспрессируемой деубиквитиназы и исследуемых белков в ходе
клеточного
цикла
в
фазе
перехода
G1/S.
Результаты дают основание предположить, что деубиквитиназа Usp28
способствует переходу G1/S в клеточном цикле, стимулируя
пролиферацию клеток и ускоряя развитие злокачественной опухоли.
Таким образом, с большой вероятностью можно предположить, что
деубиквитиназу
Usp28
следует
рассматривать
как
наиболее
перспективный кандидат на мишень для новой таргетной фармакотерапии
аденокарциномы кишечника.
10

11.

Спасибо за внимание!
11
English     Русский Rules