Микробиологическая лаборатория и ее задачи. Микроскоп и работа с ним. Морфология шаровидных бактерий

1.

Куб ГАУ
кафедра микробиологии,
эпизоотологии и
вирусологии
Ведущий преподаватель
доктор биологических наук,
профессор
Нино Нодариевна Гугушвили

2. Лабораторные занятия по общей микробиологии для факультета ветеринарной медицины

3.

Тема:
Микробиологическая
лаборатория и ее задачи.
Микроскоп и работа с ним.
Морфология
шаровидных
бактерий.
Техника
безопасности
в
лаборатории

4.

Задание:
1.Изучить правила и технику безопасности при
работе в бактериологической лаборатории.
2. Изучить методы исследований, применяемые в
микробиологической практике.
3. Изучить устройство микроскопов и правила
работы с ними.
4. Изучить морфологию шаровидных бактерий по
рисункам, муляжам, зарисовать.
5. Освоить методику микроскопирования убитых
микробов в готовых окрашенных препаратах в
сухой
и
иммерсионной
системе,
методику
определения подвижности микробов в препарате
«раздавленная капля", зарисовать.

5.

Нa
практических
занятиях
преподаватели и студенты должны
помнить, что они имеют дело с
микроорганизмами, которые далеко
не всегда могут быть безвредными
для окружающей среды и здоровья
человека. Поэтому при работе в
микробиологической
лаборатории
необходимо
всегда
соблюдать
следующие правила личной и общественной безопасности:

6.

1. Работать в халате.
2. В лаборатории не принимать пищу, воду, не
допускать излишних разговоров и хождения.
3. Работать только за своим рабочим местом и
прикрепленным к нему оборудованием.
4.
Работать
сидя,
после
окончания
работы
тщательно продезинфицировать и вымыть руки с
мылом.
5. Использованную посуду, стекла помещают в 1 %й
раствор хлорамина. Пинцеты и бактериологические
петли фламбируют.
6. Стол, одежду, обувь и другие предметы, случайно
загрязненные
исследуемым
материалом
или
культурой
микроорганизмов,
подвергают
дезинфекции.
7. После окончания работы нужно поставить в
термостат засеянные чашки и пробирки. Культуры
микробов и остатки исследуемого материала сдать
преподавателю, рабочее место привести в порядок.

7.

2. Изучить методы исследований, применяемые в
микробиологической практике
Бактериоскопический
приготовление мазков,
специальными методами
1)
метод
–
включает
в
себя
окраску их по Граму, окраску
и последующее микрокопирование.
Бактериологический метод – включает в себя посевы на
обычные и специальные питательные среды с целью
изучения культуральных, тинкториальных и биохимических
свойств чистой культуры.
2)
Биологический метод (метод биопробы) – заключается в
определении патогенных микроорганизмов путём заражения
лабораторных животных.
3)
Серологический метод – основывается на идентификации
бактерий по сыворотке крови, взятой от больного или
переболевшего животного в различных серологических
реакциях.
4)

8.

3. Изучить устройство микроскопов и
правила работы с ними
Изучение мелких объектов невозможно без
использования
увеличительных
приборов.
Размеры бактерий и микроскопических грибов
измеряются в микрометрах (10-6м), поэтому для
изучения их морфологии требуется достаточно
большое
увеличение,
которое
обеспечивают
различные виды микроскопов.
В лабораториях, как правило, имеются
световые
микроскопы,
т.е.
для
освещения
микроорганизмов используют либо естественное,
либо
искусственное
освещение
(от
лампы
накаливания).
На
следующем
рисунке
представлен монокулярный микроскоп. В нашей
стране бинокулярные микроскопы марки ЛОМО
производят
на
Ленинградском
оптикомеханическом объединении (г. Санкт-Петербург).

9.

Бинокулярный микроскоп

10.

Световой монокулярный микроскоп

11.

Оптическая схема светового микроскопа
ордр

12.

Механическая часть
микроскопа включает штатив, состоящий
из основания и тубусодержателя. К
тубусодержателю прикреплены: револьвер,
вращающийся
диск с гнездами для
объективов
и
предметный
столик
с
клеммами, препаратоводителем. Тубус
передвигают
вверх-вниз
при
помощи
макро- и микрометрических винтов. Тубус
соединен с тубусодержателем головкой на
резьбе с помощью винта.
Оптическая часть микроскопа:
осветительный аппарат (зеркало
или
лампа
искусственного
освещения),
конденсор,
диафрагма,
светофильтры,
объективы и окуляры.

13.

Штатив имеет основание и колонку
(тубусодержатель). К нему примыкают
коробка механизмов, система зубчатых
колес для регуляции положения тубуса.
Система
приводится
в
движение
вращением
макрометрического
и
микрометрического винтов.
Макрометрический винт (макровинт)
служит для ориентировочной установки
изображения рассматриваемого объекта.
Микрометрический винт (микровинт)
используют
для
получения
более
контрастного
изображения
объекта,
изменяя фокусное расстояние. При полном
повороте микровинта труба передвигается
на 0,1 мм (100 мкм).

14.

При вращении винтов по часовой
стрелке тубус опускается по направлению
к препарату, при вращении против часовой
стрелки — наоборот.
Предметный столик служит для
размещения на нем препарата с объектом
исследования и фиксации его на столике с
помощью
препаратодержателя.
Предметный
столик
перемещается
во
взаимно перпендикулярных плоскостях с
помощью винтов препаратоводителя. В
центре
столика
находится
круглое
отверстие для освещения препарата снизу
лучами света, направляемыми зеркалом
или лампочкой.

15.

Винт
перемещения
конденсора
расположен на штативе справа под столиком и
служит для перемещения конденсора с целью
регулирования светового потока, идущего от
зеркала или лампочки. Для этой же цели в сам
конденсор вмонтирована рукоятка диафрагмы.
При поднятии конденсора и раскрытии
диафрагмы
освещенность
объекта
максимальна, при опускании конденсора и
закрытии диафрагмы – наоборот минимальна.
Тубус (труба) — оправа, в которую
вставлен окуляр микроскопа. К нижней части
тубуса
прикрепляется
револьвер
(объективодержатель)
с
гнездами
для
объективов.

16.

Под предметным столиком находится
конденсор (от лат. сопdenso – уплотняю,
сгущаю),
состоящий
из
2—3
короткофокусных линз, собирает лучи,
идущие от зеркала или лампочки, и
направляет их на объект. Конденсор
необходим прежде всего при работе с
иммерсионной системой. Линзы конденсора
вмонтированы в металлическую оправу.
Интенсивность освещения в конденсоре
регулируется
ирисовой
(лепестковой)
диафрагмой, состоящей из стальных
серповидных пластинок.
Окрашенные
препараты
лучше
рассматривать
при
почти
полностью
открытой диафрагме, неокрашенные – при
уменьшенном отверстии диафрагмы.

17.

Под
конденсором
располагается
кольцевидный держатель для светофильтров
(обычно к микроскопу прилагаются синее и белое
матовые стекла). При работе с искусственным
источником
света
светофильтры
создают
впечатление дневного освещения, что делает
микроскопирование менее утомительным для глаз.
Объектив (от лат. objectum — предмет) —
наиболее
важная
часть
микроскопа.
Это
многолинзовая
короткофокусная
система,
от
качества которой зависит в основном изображение
объекта. К препарату обращена фронтальная
линза объектива. Именно она обеспечивает
увеличение.
Остальные
линзы
в
системе
объектива выполняют преимущественно функции
коррекции оптических недостатков, возникающих
при исследовании объектов.

18.

Объективы бывают сухие и погруженные
(иммерсионные).
При
работе
с
сухими
объективами между фронтальной линзой
объектива и объектом исследования находится
воздух. Оптический расчет иммерсионных
объективов предусматривает их работу при
погружении фронтальной линзы объектива в
жидкую однородную среду. При работе с
сухим объективом вследствие разницы между
показателями преломления стекла (1,52) и
воздуха
(1,0)
часть
световых
лучей
отклоняется
и
не
попадает
в
глаз
исследователя. При работе с иммерсионным
объективом необходимо поместить между
покровным стеклом и линзами объектива
кедровое масло, показатель преломления
которого близок к показателю преломления
стекла.

19.

Лучи в оптически однородной гомогенной
среде
не
меняют
своего
направления.
Иммерсионные объективы на оправе имеют
черную круговую нарезку и обозначения:
I — immersion (иммерсия), HI — homogen
immersion (однородная иммерсия),
01 — oil immersion, МИ — масляная иммерсия.
Объективы различают по их увеличению.
Студентам
необходимо
записать
характеристику объективов сухой и масляной
системы,
зарисовать ход лучей при разных
системах микроскопирования.

20.

Собственное увеличение объектива (V)
определяют по формуле:
l
V
f
где l – оптическая длина тубуса или расстояние
между фокальной плоскостью объектива и
плоскостью изображения, составляющее для
разных объективов 128–180 мм;
f – фокусное расстояние объектива: чем оно
больше, тем меньше увеличение объектива
.

21.

Величина
увеличения
объективов
обозначена на их оправе (8х, 40х, 9х).
Каждый объектив характеризуется, кроме
того, определенной величиной рабочего
расстояния в миллиметрах.
У объективов с малым увеличением
расстояние
от
фронтальной
линзы
объектива до препарата больше, чем у
объективов с большим увеличением. Так,
объективы с увеличением 8х, 40х и 90х
имеют соответственно рабочие расстояния
13,8; 0,6 и 0,12 мм. расстояние до
объектива 0,12 мм, поэтому его нередко
называют «близоруким».

22.

Окуляр (от лат. okularis – глазной)
Окуляр состоит из двух линз –
глазной (верхней) и полевой, или
собирательной
(нижней),
заключенных
в
металлическую
оправу. Назначение полевой линзы –
собирать лучи, идущие от объектива,
таким образом, чтобы они проходили
через маленькое отверстие глазной
линзы.
Увеличение окуляра указано на его
оправе. Рабочее увеличение окуляров
колеблется в пределах от 4х до 15х.

23.

Собственное увеличение окуляра вычисляют по
формуле:
L
V
F
где L – расстояние наилучшего
зрения, равное 25 см;
F – фокусное расстояние линз
окуляра.

24.

При
длительной
работе
с
микроскопом удобно пользоваться
двойными окулярами – бинокулярной
насадкой.
Бинокулярные
насадки
часто имеют собственное увеличение
(около
1,5х)
и
снабжены
коррекционными линзами. Корпуса
насадки
могут
раздвигаться
в
пределах 55–75 мм, в зависимости от
расстояния
между
глазами
наблюдателя.

25.

Качество
микроскопа
определяется
его
увеличительной и разрешающей способностями.
Увеличительная способность микроскопа
Коэффициент
увеличения
микроскопа
определяется
произведением
увеличения
окуляра (К) и увеличением объектива (V):
D K V

26.

Основные методы микроскопии
1)Микроскопия в темном поле
В основе метода лежит эффект Тиндаля –
рассеивающийся пучок света при наблюдении
сбоку имеет вид голубоватого конуса на темном
фоне. При освещении объекта косыми лучами
света эти лучи, не попадая в объектив, остаются
невидимыми для глаза, поэтому поле зрения
выглядит темным, но оптически неоднородные
клетки, находящиеся в поле зрения и попадающие
в сферу прохождения лучей, отклоняют их в такой
степени, что лучи попадают в объектив. Поскольку
лучи
света
идут
именно
от
объектов,
исследователь видит их в темном поле интенсивно
светящимися.

27.

2) Метод фазово-контрастной
микроскопии
Разработан
для
наблюдения
за
прозрачными объектами. Он основан на
преобразовании
фазовых
изменений,
претерпеваемых световой волной при
прохождении через объект, в видимые
амплитудные с помощью определенного
оптического устройства:
фазово-контрастное устройство состоит из
фазовых объективов (на оправе имеется
буква «Ф»), конденсоров с набором
кольцевых диафрагм и вспомогательного
микроскопа
(оптического
устройства,
помещаемого в тубус вместо окуляра при
установке фазового контраста

28.

3)Люминесцентная, или
флуоресцентная, микроскопия
Ряд
биологических
объектов
способен
при
освещении
коротковолновыми
лучами
(синефиолетовыми,
ультрафиолетовыми)
поглощать их и испускать лучи с
более длинной волной. При этом
клетки
будут
светиться
желтозеленым или оранжевым светом. Это
собственная,
или
первичная,
люминесценция.

29.

Нелюминесцирующие объекты можно
обработать
специальными
флуоресцирующими
красителями
–
флуорохромами
(акридином
желтым,
акридином
оранжевым,
аурамином,
примулином, тиофлавином, конго красным,
калькофлером белым) и также наблюдать
люминесценцию. Это будет наведенная,
или вторичная, люминесценция.
Препараты,
окрашенные
флуорохромами, изучают в средах, не
люминесцирующих
под
действием
коротковолновых
лучей:
в
воде,
глицерине,
вазелиновом
масле
или
физиологическом растворе.

30.

4) Электронная микроскопия
В отличие от светового микроскопа
освещение объекта происходит не лучами
света,
а
потоком
электронов.
Трансмиссионный электронный микроскоп
состоит
из
электронной
пушки,
электромагнитных
катушек,
которые
выполняют
роль
конденсорной,
проекционной
и
объективной
линз,
предметного столика, экрана, окуляра и
вакуумного насоса.
Исследуются целые
клетки и срезы клеток. Сканирующий
электронный микроскоп дает трехмерное
изображение
объекта.
Разрешающая
способность
электронных
микроскопов
достигает 0,2–0,4 нм, увеличение –
100 000 раз.

31.

Электронный микроскоп
микро

32.

Клетки бактерий в сканирующем электронном микроскопе ( x
11000).

33.

4. Изучить морфологию шаровидных бактерий
по рисункам, муляжам, зарисовать
Рис. 3.
Микроскопическая картина
шаровидных
бактерий,
простая
окраска,
объектив 90х15)
(препарат
иммерсия,

34.

1 – Микрококки (Micrococcus),
2 – диплококки (Streptococcus),
3 – стрептококки (Streptococcus),
4. – стафилококки (Staphylococcus),
5 – сарцина (Sarcina),
6 – бактерии,
7 – спириллы, 8 – вибрионы

35. Шаровидные формы бактерий

1–
моно/микрококк
2 – диплококк
3 – тетракокк
4 - стрептококк
5 – сарцина
6 - стафилококк

36. Шаровидные формы бактерий

стрептококк
в чистой культуре
в гное
стафилококк
в чистой культуре
в гное

37. Кокковидные и палочковидные формы бактерий

1 – микрококки;
2 – диплококки;
3– стрептококки;
4 – тетракокки;
5 – сарцина;
6 – стафилококки
1 – эшерихии;
2 – клебсиеллы;
3 – бруцеллы;
4 – бациллы;
5 –
коринебактерии;
6 – фузиформные
бактерии;
7 – клостридии;
8 – иерсинии;

38.

4. Исследование живых клеток
микроорганизмов методами раздавленной и
висячей капли
В обоих случаях окрашивание объекта
проводят
«прижизненными»
красителями
–
витальная
окраска.
Прижизненными
красителями могут служить метиленовый синий,
нейтральный красный в концентрациях от 0,001
до 0,0001%.
Оба метода применяют для выявления
подвижности
клеток
микроорганизмов,
наблюдения за размножением, образованием и
прорастанием
спор,
установления
реакции
микроорганизмов на химические соединения и
физические
факторы
воздействия,
изучения
размеров клеток, характера их расположения,
определения запасных веществ в клетке.

39.

Препараты
микроскопируют,
слегка
затемняя
поле
зрения;
конденсор
немного
опускают,
поступление
света
регулируют
вогнутым
зеркалом.
Вначале
пользуются малым увеличением –
объектив
8х,
после
того
как
обнаруживают
край
капли,
устанавливают объектив 40х или
иммерсионный (90х). Более четкие
результаты можно получить при
микроскопии в темном поле или в
фазовом контрасте.

40.

При
использовании
метода
раздавленной
капли
на
чистое
предметное
стекло
наносят
каплю
водопроводной
воды.
В
нее
вносят
культуру и смешивают с водой. Накрывают
каплю покровным стеклом так, чтобы под
ним не образовывались пузырьки воздуха.
Стеклянной
палочкой
прижимают
покровное стекло к предметному и удаляют
избыток воды фильтровальной бумагой,
поднося ее к краям покровного стекла. При
просмотре приготовленного препарата под
микроскопом с иммерсионным объективом
на покровное стекло наносят каплю
кедрового масла.

41.

Метод удобен для исследования
подвижности
бактериальных
клеток,
а
также
просмотра
крупных
объектов
–
микроскопических
грибов,
дрожжей. Его применяют также
при изучении запасных веществ
клетки.

42.

Для длительных наблюдений за клетками
микроорганизмов применяют метод висячей
капли.
Для
него
требуется
специальное
предметное стекло с лункой посередине. На
стерильное покровное стекло наносят иглой
негустую
суспензию
микроорганизмов,
выращенных в жидкой питательной среде или
подготовленных для данной цели. При
выращивании
на
плотной
среде
микроорганизмы предварительно разводят в
физиологическом
растворе
(0,5%
NaCl).
Покровное
стекло
переворачивают
и
помещают на стерильное предметное стекло с
лункой так, чтобы капля свободно свисала в
лунку.
Для
герметичности
края
лунки
смазывают вазелином.

43.

Размеры бактериальных клеток
варьируют в широких пределах.
Диаметр кокков и палочек составляет
0,3–1,5 мкм, а длина палочковидных
бактерий может достигать 10 мкм.
Максимальную длину клеток имеют
спирохеты – до 500 мкм, но они
остаются невидимыми в связи с
ничтожно
малым
диаметром
их
клеток.

44.

Типы расположения жгутиков и механизмы движения
бактерий

45. Расположение жгутиков у бактерий

1 – монотрихи; 2 – амфотрихи; 3 – лофотрихи; 4 - перитрихи

46.

Формы и расположение спор у бацилл и клостридий
1– бациллярное центральное,
2 – бациллярное терминальное,
3 и 5 – плектридиальное,
4 – клостридиальное,
6 – латеральное

47. Споры расположение

1 – центральное; 2 – терминальное;
3 – субтерминальное
1 – бациллы сибирской язвы;
2 – клостридии столбняка;
3 – клостридии ботулизма

48. Благодарю за внимание!