Производство микробного жира. Выделение липидов методом экстракции

1.

Производство микробного жира.
Выделение липидов методом
экстракции
СТ УДЕН Т
Г Р. Х - 4 7 0 0 0 7
П РЕПОДАВАТ ЕЛ Ь
Б Л АН К М .В .
Б ЕРС ЕН ЕВА В.С .

2.

ВВЕДЕНИЕ
Основными источниками липидов для человека в настоящее время являются растительные и животные жиры. В
организме человека жиры выполняют важные функции, благодаря чему их относят к основным пищевым веществам.
Они необходимы организму точно так же, как белки и углеводы, так как являются носителями незаменимых веществ.
1. Они имеют высокую энергетическую ценность, превосходя энергию белков и углеводов более чем в два раза.
2. Жиры участвуют в пластических процессах, они необходимы для нормального усвоения жирорастворимых
витаминов - ретинола (витамина А), эргокальциферола (витамина В2), токоферола (витамина Е), филлохинонов
(витамина К), некоторых микроэлементов, например кальция и магния.
3. Они повышают вкусовые качества пищи, вызывают чувство длительной насыщаемости.
Безжировое питание или длительное ограничение жиров в питании может нанести вред организму, что
выражается в нарушении функции нервной системы, почек, органов зрения. Кроме этого изменяется химический
состав тканей, возникают заболеваний кожи, снижается физическая активность организма и его сопротивляемость
болезням, укорачивается продолжительность жизни.
2

3.

Наряду с потреблением огромного количества жиров для пищевых целей значительная их часть используется и в
разных отраслях промышленности (медицинская, химико-фармакоцевтическая, лакокрасочная, шинная, производство
мыла, металлургия и т. д.)
В настоящее время ведутся поиски новых источников жиров. И в качестве реальной базы для их получения для
технический целей могут стать микроорганизмы, которые уже зарекомендовали себя как своеобразные «фабрики»
производства спирта, различных органических кислот, витаминов, белка, ферментов и т.д.
Для производства липидов микробного происхождения может быть использовано дешевое сырье. Таким
дешевым сырьем являются гидролизаты древесины или торфа, а также продукты нефти.
3

4.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
4

5.

ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОБНЫХ ЛИПИДОВ
Микробные липиды имеют в основном техническое
назначение, а именно: используются для производства корма для
скота, в косметической и фармацевтической промышленности. Но
попутно с микробными липидами могут синтезироваться в
зависимости от штамма продуцента и условий культивирования
жирорастворимые витамины А, D, E, которыми обогащаются
продукты функционального питания. Кроме того, в дрожжах
накапливаются липолитические ферменты, которые могут быть
использованы в кондитерской промышленности.
5

6.

ВОЗМОЖНЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ
Концентрация липидов в клетках микроорганизмов составляет до 75% сухой биомассы. В состав липидов
микроорганизмов входит сравнительно много ненасыщенных жирных кислот. Соотношение насыщенных и
ненасыщенных кислот зависит не только от свойств продуцента, но и от условий культивирования. Общее количество и
соотношение жирных кислот зависит и от присутствия K, Na, Mg и их соотношения в среде. Синтез липидов стимулирую
ингибиторы углеводного обмена, например, арсенит натрия.
Технологический процесс получения микробных липидов, в отличие от получения белковых веществ, обязательно
включает стадию выделения липидов из клеточной массы методом экстракции в неполярном растворителе (бензине или
эфире). При этом получают одновременно два готовых продукта: микробный жир (биожир) и обезжиренный белковый
препарат (биошрот).
6

7.

ДРОЖЖИ
Способность к усиленному накоплению липидов имеет промышленное значение, ею
обладают немногие микроорганизмы, в первую очередь дрожжи. Процесс образования
липидов у большинства дрожжей состоит из двух четко разграниченных стадий: первая
характеризуется быстрым образованием белка в условиях обильного снабжения культуры
азотом и сопровождается медленным накоплением липидов (в основном
фосфоглицеридов и нейтральных жиров); вторая - прекращением роста дрожжей и
усиленным накоплением липидов (в основном нейтральных липидов).
Типичными липидообразователями являются дрожжи Cryptococcus terricolus,
отличительная особенность которых - способность синтезировать большое количество
липидов (до 60% от АСВ) в любых условиях, даже наиболее благоприятных для синтеза
белка. Из других липидообразующих дрожжей промышленный интерес представляют
дрожжи Lipomyces lipoferus и Rhodotorula gracilis, накапливающие большие количества
липидов (50-60% от АВС) и активно развивающиеся на углеводных субстратах, в том числе
и на мелассе, гидролизатах торфа и древесины. У этих видов дрожжей липогенез очень
сильно зависит от условий культивирования.
7

8.

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ
Микроскопические грибы пока не получили широкого
распространения как продуценты липидов, хотя жир грибов
по своему составу приближается к растительным жирам и
выход жиров у Asterreus. Ha углеводных средах достигает
51% от АСВ. Липидный состав грибов представлен в
основном нейтральными жирами и фосфолипидами.
8

9.

БАКТЕРИИ
Особенность бактерий как продуцентов липидов заключается в
своеобразии состава их липидов, включающих, в основном,
сложные липиды (фосфо- и гликолипиды), тогда как нейтральные
жиры составляют очень небольшую часть биомассы. Однако с
учетом более разнообразного состава жирных кислот (от С10 до С20),
входящих в жирорастворимую часть бактериальных клеток, вопрос
о промышленном использовании липидов бактерий может
возникнуть при необходимости получения специфических жирных
кислот.
9

10.

ВОДОРОСЛИ
Водоросли представляются очень перспективными для
культивирования их в качестве липидообразователей, так
как они не нуждаются в органическом источнике углерода
для биосинтеза белка, углеводов и жира. Химический
состав водорослей сильно зависит от условий
культивирования: меняя содержание азота в среде, можно
получить клетки, имеющие 58% от АСВ белка и 5% от АСВ
жира или всего около 8% от АСВ белка и до 85% от АСВ
жира. Однако наличие таких недостатков, как малая
скорость роста и накопление в клетках токсических
соединений, ограничивает их промышленное применение.
10

11.

ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
ДРОЖЖЕЙ
Итак, основную роль в процессе биосинтеза липидов играют различные штаммы дрожжей. Они используют те же источники сырья, что и для
получения кормового белка, причем от ценности углеродного питания зависят выход биомассы, количество и состав синтезируемых липидов. Для
обеспечения направленного биосинтеза липидов в питательной среде употребляются легкоассимилируемые источники азота.
На сдвиг биосинтеза в сторону образования липидов или белка влияет соотношение углерода и азота в среде. Так, повышение концентрации азота
вызывает снижение липидообразования, а недостаток азота при обеспеченности углеродом ведет к понижению выхода белковых веществ и высокому
процентному содержанию жира. Установлено, что оптимальное соотношение N:С тем меньше, чем труднодоступнее для дрожжей источник углерода.
Обычно для углеводородного сырья соотношение N:C = 1:30, а для углеводного - 1:40. Накопление липидов возможно только при наличии в среде фосфора.
При его недостатке источники углерода используются не полностью, при избытке - накапливаются нелипидные продукты. На фракционный состав липидов
изменение содержания фосфора влияния не оказывает.
На фракционный состав синтезируемых липидов оказывают другие условия культивирования: аэрация, рН и температура. От интенсивности аэрации
зависит синтез фосфоглицеридов, жирных кислот и триацилглицеридов. При недостаточной аэрации липиды содержат в 4 раза меньше
триацилглицеридов, в 2 раза больше фосфоглицеридов и в 8 раз больше жирных кислот, чем при нормальной. При интенсификации аэрации возрастает
степень ненасыщенности липидов и увеличивается относительное количество всех групп ненасыщенных кислот. Повышение рН среды ведет к увеличению
содержания фосфоглицеридов и жирных кислот при одновременном снижении количества триацилглицеридов. Оптимальные температуры роста и
липидообразования для клеток совпадают, причем содержание липидов не зависит от температуры культивирования. Однако, регулируя температуру,
можно создавать разные соотношения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в составе фосфолипидных мембран.
11

12.

ЭКСТРАКЦИЯ ЛИПИДОВ
Липиды характеризуются, как правило, нерастворимостью в воде и
растворимостью в различных органических растворителях. Это свойство
используется при экстракции их из изучаемого объекта. В идеальном
случае процедура экстракции клеточных липидов должна приводить к
количественному извлечению этих соединений в неизмененном виде.
Эффективность экстракции липидов в значительной степени зависит
от химической природы липидных компонентов и от вида комплексов,
которые образуют липиды в клетке с другими классами природных
соединений.
12

13.

Известны три основных типа взаимодействий липидов с веществами.
1. Гидрофобное взаимодействие нейтральных или неполярных липидов, которое связывает относительно слабыми
нековалентными связями их углеводородные цепи с другими липидами или с гидрофобными участками белков.
Такое взаимодействие осуществляется, в частности, в жировой ткани, хиломикронах и др.
2. Электростатическое взаимодействие, при котором полярные липиды образуют связи с протеинами, как это имеет
место в мембранах.
3. Образование комплексов, в которых жирные кислоты и оксикислоты связаны ковалентными связями с
полисахаридами и белками.
Из комплексов, образованных в результате гидрофобного взаимодействия, липиды можно экстрагировать
относительно неполярными растворителями, такими как этиловый эфир, хлороформ или бензол.
Полярные липиды экстрагируются растворителями, уменьшающими гидрофобные взаимодействия между липидными
молекулами и, в то же время, разрушающими водородные связи и нарушающими электростатические взаимодействия
липидов с белками, такими как этанол или метанол.
Ковалентно связанные с мембранными белками липиды можно выделить, лишь расщепив комплекс липид-белок с
помощью кислотного или щелочного гидролиза.
13

14.

При выделении липидов из биологического материала может происходить их окисление и деградация,
приводящие к образованию побочных продуктов. Поэтому выделение липидов необходимо производить быстро в
условиях, максимально исключающих влияние таких факторов, как повышенные температуры, присутствие
окислителей, отсутствие подходящего растворителя. Для предотвращения окисления липидов непосредственно перед
проведением экстракции растворители перегоняют, удаляют из них перекиси.
Липидный экстракт не должен быть загрязнен нелипидными веществами, такими, как сахара и аминокислоты.
Однако смеси растворителей для экстракции липидов, содержащие спирт, наряду с липидами экстрагируют
содержащие в клетках нелипидные вещества. Освобождают липиды от нелипидных примесей промывкой экстракта
водой, слабыми солевыми растворами (KCl, СаCl2).
14

15.

МЕТОД ФОЛЧА
Одним из наиболее распространенных методов экстракции липидов является метод
Фолча. Экстракцию проводят смесью хлороформ:метанол (2:1). Метод позволяет выделить
90-95% всех клеточных липидов. Для удаления нелипидных примесей к экстракту
добавляют воду или слабые солевые растворы (обычно 1/5 часть от объема экстракта). В
результате образуется двухфазная система, нижний слой которой состоит из хлороформа,
а верхний - из смеси метанола и воды. Водорастворимые нелипидные соединения
переходят в водно-метанольный слой. Однако в ходе промывок экстракта водой
фосфолипиды и лизофосфолипиды могут переходить в водную фазу и, таким образом,
теряются.
В зависимости от целей экспериментов существуют различные модификации метода
Фолча (изменение температурного режима экстракции, применение различных
растворителей в различных соотношениях и др.).
15

16.

ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТЬ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА
Целесообразность получения липидов биотехнологическим методом заключается в том, что полученные таким
образом, они представляют собой дополнительный сырьевой источник, имеющий техническое назначение,
следовательно, позволяет сэкономить сырье растительного и животного происхождения, таким образом, получение
липидов (так же как и белков) микробиологическим способом позволяет решить проблему продовольственной
безопасности. Более того, если предположить, что будет найден химический (или иной) способ производства данного
продукта, то наверняка окажется более затратным, поскольку только в процессах биотехнологии можно использовать
дешевые отходы сельского хозяйства и промышленности.
Биотехнологические процессы по сравнению с химическими обычно более экологичны, имеют меньше вредных
отходов, близки к протекающим в природе естественным процессам, протекают при относительно невысоких
температурах и давлениях. Как правило, технология и аппаратура в биотехнологических производствах более просты и
дёшевы. Среди биотехнологических способов наивысший выход липидов обеспечивает культивирование дрожжей рода
Lipomyces lipoferus на гидролизатах торфа, являющихся дешевым и возобновляемым сырьевым ресурсом.
16