Методы определения микробной биомассы в почве

1.

Методы определения
микробной биомассы в
почве
И.В. Евдокимов

2. Задачи почвенной микробиологии в широком контексте междисциплинарных проблем современной науки

Определение запасов и
потоков биофильных
элементов через
микробную биомассу
Определение
дыхательной и
ферментативной
активности микробного
сообщества
Определение
структуры микробного
сообщества
Роль микробиоты в
регуляции потоков
парниковых газов и,
таким образом, в
глобальных изменениях
климата
Функционирование
ризосферы и
дриллосферы как
гологеномов
Определение
взаимосвязей между
структурой и
функциями микробного
сообщества

3. Методы определения микробной биомассы– классификация по принципу получения аналитического сигнала

I. Методы, основанные на анализе биомаркеров :
PLFA-PLEL (ЖК фосфолипидов), LPS,
гликолипидов, эргостерола, хинонов и др. Анализ
ATФ, ДНК и РНК - неспецифических биомаркеров.
II. Биоцидные методы - фумигационный (FI, FE),
регидратационный (RI, RE).
III. Методы, основанные на дыхательном отклике
микробного сообщества –
субстрат-индуцированного дыхания (СИД, SIR),
кинетический ( KSIR).

4. I. Методы, основанные на анализе биомаркеров

5. Метод жирных кислот фосфолипидов (ЖКФ) - phospholipid fatty acids (PLFA) profiling

Метод жирных кислот фосфолипидов (ЖКФ) phospholipid fatty acids (PLFA) profiling
Принцип метода:
Метод PLFA основан на анализе жирных кислот фосфолипидов
(ЖКФ), входящих в состав мембран. ЖКФ не входят в состав
запасных веществ клетки, а после смерти клетки подвергаются
быстрому биохимическому разложению под действием
внеклеточных ферментов. Это делает PLFA (ЖКФ) отличными
маркерными веществами, а полученные по результатам
анализов PLFA (ЖКФ) микробные профили могут быть
использованы для качественного и количественного анализа
микробного сообщества почвы.

6.

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов)
Структура микробного
сообщества (выделение
больших групп):
Мембранные
липиды
Микоризные грибы
Прочие грибы
Грам - бактерии
Грам + бактерии
«Неспецифическая»
информация:
общее кол-во липидов
(биомасса)
Актиминоцеты
Архебактерии
Простейшие

7.

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов)
Маркеры для групп организмов:
Среди наиболее часто используемых кислот (список – НЕ
исчерпывающий) выделяют следующие классы:
SATFA (saturated fatty acids, насыщенные жирные
кислоты)
Как правило, являются маркерами Г+ бактерий.
Исключения:
циклические PLFA (c префиксом Cy)– являются маркерами Г-
бактерий;
n14:0, n15:0 - неспецифические (встречаются и у Г+, и у Г-);
Длинноцепочечные (длиннее С20) – маркеры эукариот
(простейшие, растения).

8.

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов)
Маркеры для групп микроорганизмов:
MUFA (mono-unsaturated fatty acids,мононенасыщенные
жирные кислоты)
Как правило, являются маркерами Г- бактерий.
Исключения:
16:1w5 – маркер для арбускулярных микоризых грибов;
18:1w9 – маркер для сапротрофных грибов.

9.

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов)
Маркеры для групп микроорганизмов:
PUFA (poly-unsaturated fatty acids, полиненасыщенные
жирные кислоты)
Как правило, являются маркерами для сапротрофных грибов.
Наиболее распространенный в почве маркер для
сапротрофных грибов - 18:2w6,9.
Прочие маркеры:
18:1w7 – маркер для метанотрофов;
10Me18:0, 10Me17:0, 10Me16:0 – маркеры для актиномицетов.

10.

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов)
–
–
–
Преимущества:
Позволяет «напрямую» применить метод стабильных
изотопов (stable isotope probing, SIP) с целью выявления
групп микроорганизмов, ответственных за определенные
процессы/последовательности реакций цикла углерода.
Может быть использован не только для качественного, но и
количественного анализа микробной биомассы в почве.
Соотношения между группами PLFA являются хорошими
индикаторами стресса в почве.
Недостатки:
Не дает возможности определять микроорганизмы до вида
или рода (за исключением актиномицетов).
Необходимость сложных экстракций с токсическими
растворителями – по сути дела, это сложный метод
органической химии с газохроматографическим окончанием.
Сложность с идентификацией пиков и однозначной
привязкой их к стандартам-ЖКФ.

11.

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов) – «отцыоснователи»

12.

Метод PLFA (жирных кислот фосфолипидов) – «отцыоснователи»

13.

Индикаторы стресса по результатам анализа ЖКФ (stress
indicators as determined by PLFA analyses)
Основные индикаторы
Соотношение «грамположительные бактерии/
грамотрицательные бактерии» (Gram-positive-to-Gram-negative
ratio). Соотношение «насыщенные ЖКФ/мононенасыщенные
ЖКФ» как аналог данного индекса (SATFA/MUFA ratio as an
analogue of that index).
Соотношение trans/cis изомеров (напр., 16:1w7t/16:1w7).
Соотношение «циклические ЖКФ/их моноеновые
предшественники» (cyclopropyl PLFA to monoenoic precursors
ratio) – напр., в парах cy17:0/16:1w7 и cy19:0/18:1w7.
Вспомогательные индикаторы:
Относительное обилие тех или иных специфических ЖКФ –
маркеров микромицетов, бактерий, простейших и т.д.
(abundance of specific PLFA – markers of fungi, bacteria, protozoa
etc). Соотношение «грибы/бактерии» (fungi/bacteria ratio).

14.

Метод PLFA (жирных кислот)
Как это выглядит (стадии экстракции):
Университет г. Гёттинген, Германия

15.

Метод PLFA (жирных кислот)
Как это выглядит (стадии дериватизации):
Университет г. Гёттинген, Германия

16. Метод PLFA (жирных кислот)

Как это выглядит (оборудование):

17. Выделение ДНК из почвы

Как это выглядит (I), стадии 1 – 4 :

18. Выделение ДНК из почвы

Как это выглядит - стадии 5 - 8 (II) :

19. Выделение ДНК из почвы

Как это выглядит - стадия 8 с дальнейшим определением
концентрации ДНК (III) :
Полимеразная цепная
реакция, ПЦР (PCR)

20. II. Биоцидные методы

21. Фумигационный метод

Принцип метода
Почва подвергается воздействию паров фумиганта в
течение 24 ч (чаще всего, хлороформа CHCl3 ), а биомасса
микроорганизмов, убитых этой биоцидной обработкой,
определяется по приросту (flush) в выделении СО2 при
последующей инкубации почвы - метод фумигации
инкубации, fumigation-incubation (FI) (Jenkinson & Powlson,
1976), либо по приросту (flush) растворимых соединений
углерода (в других вариантах - азота, фосфора или серы) –
метод фумигации-экстракции, fumigation-extraction (FE)
(Brookes et al., 1985).

22. Фумигационный метод

Этапы определения методом фумигации (I)
Открытые чашки/стаканчики/сосуды с почвой (навески 20 – 40 г в
пересчете на абс.сух.) помещают в эксикатор, дно которого выстелено
фильтровальной бумагой, смоченной в воде. В эксикатор ставят
стаканчик с хлороформом, на дно стакана кладут стеклянные бусы для
предотвращения образования слишком больших пузырьков
хлороформа.
Закрывают эксикатор крышкой, подсоединяют вакуумный насос и
вакуумируют до появления пузырьков хлороформа в стаканчике.
Желательно, чтобы кипение продолжалось не менее 2 мин.
Отсоединяют насос, изолируют атмосферу внутри эксикатора от
внешней атмосферы, оставляют эксикатор в темноте при комнатной
температуре на 24 часа.
Открывают эксикатор, удаляют стаканчик с остатками хлороформа.
Затем подсоединяют насос и вакуумируют систему в течение
нескольких минут, затем открывают краны, заполняя эксикатор
обычным воздухом. Повторяют процедуру 4 – 5 раз с целью удаления
остатков фумиганта в почве. Вынимают емкости с почвой из эксикатора.

23. Фумигационный метод

Этапы определения методом фумигации (II)
Делают солевые экстракты (в 0,25 – 0,5 М растворе K2SO4) из
почвы, подвергшейся фумигации, анализируют содержание
растворимого С (N, P или S).
Из полученных величин С (N, P или S) в растворе (FE) или
выделившемся СО2 (FI) вычитают соответствующие величины,
определенные в контрольной почве. Контролем служит свежая
почва, не подвергшаяся фумигации.
Рассчитывают величину биомассы по формуле
Cbio = (Fc-Ufc) / kc = flushC / kc
(или по аналогичным формулам для других биофильных
элементов),
где Fc – С в фумигированной почве, Ufc – С в контроле, kc –
пересчетный коэффициент (conversion factor), flush C – прирост
(«флаш») растворимого или минерализуемого углерода.

24. Фумигационный метод

Как это выглядит:
Институт почвенной экологии,
Научн.-иссл. Центр
Гельмгольцевского общества,
Нойерберг/Мюнхен, Германия
Университет г. Гёттинген, Германия

25. Фумигационный метод: «прямая экстракция» (Setia et al., 2012)

Принципиальное отличие от фумигации-экстракции и
фумигации-инкубации:
Замена процедуры экспозиции в парах хлороформа на
экстракцию с эмульсией хлороформа в растворе K2SO4.
Длительность экспозиции 1 ч.
Дозировка хлороформа – 1мл/10 г почвы (возд.-сух
вес).
Применяется для анализа С,N и P микробной
биомассы в почве.

26. Фумигационный метод: «прямая экстракция» (Setia et al., 2012)

Преимущества «метода прямой экстракции» по
сравнению с другими вариантами фумигационного
метода:
Отсутствие довольно утомительной и опасной процедуры
вакуумирования эксикатора.
Не нужен специальный вакуумный насос, стойкий к
органическим растворителям (экономия средств).
Экономия времени при проведении анализов: не нужно
тратить сутки на экспозицию; не нужно многократно
вакуумировать эксикатор по окончании экспозиции с
целью избавления от остаточных концентраций
хлороформа в растворе.

27. Регидратационный метод

Принцип метода
Биоцидная обработка фумигантом (как это делается в
фумигационном методе) заменяется на высушивание
почвы при 65 – 70оС в течение 24 ч. По окончании
высушивания прирост (flush) в С и N, вызванный
поступлением в почву убитой биомассы микроорганизмов,
определяется аналогично методу фумигации-экстракции
(FE), или после добавления воды – как в методе
фумигации-инкубации (FI) (Благодатский и др., 1987).

28. Регидратационный метод

Преимущества метода по сравнению с фумигационным:
Не нужно использовать токсические вещества (фумиганты).
Меньшая трудоемкость, отсутствие манипуляций с вакуумным
эксикатором.
Возможность хранить высушенные пробы длительное время,
«накапливая» их для экстракции и анализа на С и N.
Недостатки метода по сравнению с фумигационным:
– Большее количество растворенных органических веществ в
экстракте, имеющих немикробное происхождение (собственно ПОВ
становится более растворимым в результате высушивания).
–
Нет взаимозаменяемости экстрактов K2SO4 и CaCl2, которая
бывает у образцов многих сельскохозяйственных почв при
использовании метода FE.
–
Отсутствие апробации метода на широком ряде почв и
экологических условий – этот метод не является «стандартным»,
общепризнанным методом.

29. Фумигационный и регидратационный методы

Способы определения пересчетных коэффициентов (I):
Сравнение с результатами прямого микроскопирования
(Jenkinson & Powlson, 1976).
По результатам определения С или N в биомассе
микроорганизмов, выращенных на искусственных средах
(Van Veen et al., 1987) - «непрямой метод».
Для kEN – расчет по усредненному значению С:N во “flush”
после фумигации (Joergensen & Mueller, 1996) - «непрямой
метод».

30. Фумигационный и регидратационный методы

Способы определения пересчетных коэффициентов (II):
«Прямая калибровка» с внесением 13C или 14C меченого С
субстрата (при определении kEC) или 15N меченого
источника N (при определении kEN) (Brookes et al., 1985;
Jenkinson, 1988; Blagodatsky & Yevdokimov, 1998).
Большинство исследователей выбирает простой путь –
берут наиболее часто встречающиеся в литературе
величины kEC = 0,45 и kEN = 0,54 и считают величины
пересчетных коэффициентов постоянными.
Это – главный источник ошибок при применении
биоцидных методов!!!

31. Фумигационный и регидратационный методы

Способы определения пересчетных коэффициентов
(III):
• «Прямая калибровка» с изотопами с широким
интервалом величин C:N во вносимом субстрате,
либо с широком интервалом величин других
факторов (рН, почвенная влажность и т.д.) При этом
появляется возможность получить эмпирические
уравнения зависимости k от вышеперечисленных
экофизиологических факторов.

32. Фумигационный и регидратационный методы

Способы определения пересчетных
коэффициентов (IV):
• Примеры таких эмпирических уравнений:
kEC = 0,2 (C/N)0,3
C:N в калибровочном эксперименте колебалось от 3,4 до
36,2, при этом kEC варьировали от 0.18 (при максимальной
величине C:N) до 0,62 (при минимальной) (Yevdokimov et
al., 2006).
kEN = (4,7 (1 – kEC) + (C/N) kEC) kEC/(C/N) (Blagodatsky &
Yevdokimov, 1998).
Общая закономерность: чем выше соотношение C:N, тем
ниже пересчетный коэффициент.

33. Фумигационный метод

Трудности при определении фосфора микробной
биомассы в почве:
Необходимо количественно определить сорбцию Рсодержащих соединений.
Необходимо количественно определить изотопный обмен
при определении пересчетного коэффициента в опытах с
радиоактивной меткой азота (32Р и 33Р).
В связи с этим перспективным представляется
использование анионно-обменных смол (anionexchange membranes, AEM).

34.

Экспериментальное
определение
Мечение изотопом
33P
коэффициента сорбции
Rsorp
Ионообменные
мембраны показали
гораздо более
высокое сродство
к фосфатам, чем
поверхность
почвенных частиц,
поэтому…
Экспериментальное
Для всех
типов почв
можно
использовать
0.9
для
Rsorp и
определение
коэффициента
Rexch
изотопного обмена
Rexch
kP следует
Экспериментальное
определение
пересчетного
коэффициента kP на
основе Rsorp
и Rexch
определять
kP показал сильную
специфичность для
каждой почвы,
вероятно, из-за
колебаний соотн.
«грибы:бактерии»,
поэтому…
отдельно для
каждой
почвы,
используя
мечение с
33P

35.

Результаты. Извлекаемость 33P после сорбции и изотопного
обмена во время ионообменной процедуры (%); пересчетные
коэффициенты для расчета микробного P (+ SE)
Извлекаемость с
учетом
Почва
сорбции, %
Извлекаемость с
учетом
изотопного
обмена, %
Пересчетный
коэффициент
Rsorp
Rexch
kp
Phaeozem
87+1 a
87+1 a
0.30+0.02 б
Kastanozem
85+1 a
89+1 a
0.38+0.02 в
Chernozem
92+2 б
88+1 a
0.19+0.01 a
Podzol
91+2 б
98+2 б
0.32+0.01 б
Буквами показаны существенные различия между почвами при P < 0.05,
Yevdokimov et al., 2016
определенные по тесту Тьюки (n=3).

36.

Фумигационный метод: «прямая экстракция» при
определении микробного Р

37.

Фумигационный метод: «прямая экстракция» при
определении микробного Р

38.

Использование концентрации ДНК, выделенной из
почвы, в качестве индекса общей микробной
биомассы
Joergensen (2006) :
Cмик (мкг/г почвы) = FPLFA × PLFA (нмоль/г почвы),
где FDNA – пересчетный коэффициент. Величины пересчетного
коэффициента составили:
FPLFA = 5,8 – при калибровке по методу фумигации-экстракции (FE)
FDNA = 6,0 – “ – “ -
Semenov et al. (2017) :
Cмик (мкг/г почвы) = FDNA × dsDNA (мкг/г почвы),
где FDNA – пересчетный коэффициент. Величины пересчетного
коэффициента составили:
FDNA = 4,4 – при калибровке по методу фумигации-экстракции (FE)
FDNA = 5,1 – при калибровке по методу СИД (SIR)

39. III. Методы, основанные на определении дыхательного отклика микробного сообщества

40. Метод субстрат-индуцированного дыхания (СИД) – Substrate induced respiration (SIR)

Принцип метода
В почву вносят глюкозу и определяют дыхательный
отклик микробного сообщества на внесение
легкодоступного субстрата, продолжающийся в
течение первых 3 - 4 ч (Anderson & Domsch, 1978).
Углерод микробной биомассы рассчитывается с
использованием пересчетного коэффициента.

41. Метод СИД (SIR)

Этапы определения методом СИД (SIR)
В навеску почвы 10 – 40 г вносят раствор глюкозы или
сухую глюкозу, перемешанную с тальком, прокаленным
песком или др. инертным веществом. Почву, обогащенную
углеродным субстратом, помещают в сосуд/ пластиковую
трубку, герметично изолированную от окружающей
атмосферы эластичной крышкой или мембраной, и
инкубируют в течение нескольких часов в термостатических
условиях.
Производят периодическое (каждые 0,5 – 1 ч) определение
скорости выделения СО2 из почвы (почвенного дыхания).
Рассчитывают углерод микробной биомассы y (мкг С/ г) по
следующей формуле:
y = 40,04x + 0,37 ,
где x – интенсивность дыхания (мкл СO2/( г * ч)) – Anderson &
Domsch (1978).

42. Метод СИД (SIR)

Определение скорости выделения СО2:
Газохроматографическое – анализ производится на газовом хроматографе
- gas chromatograph, GC (вручную или с автоматизированной системой
пробоотбора и измерений).
Методом инфракрасной спектроскопии –анализ производится на
инфракрасном газовом анализаторе – infrared gas analyzer (IRGA) (вручную
или с автоматизированной системой пробоотбора и измерений). .
Адсорбционным методом - почва помещается в пластиковые стаканчики,
стаканчики герметически изолируют в микрокосме с емкостью, содержащей
раствор КОН. Измерения проводимости раствора щелочи производятся
автоматически через заранее установленные интервалы времени.
Уменьшение проводимости пропорционально поглощению СО2 из
атмосферы микрокосма.

43. Метод СИД (SIR)

Преимущества СИД по сравнению с биоцидными методами
Не нужно использовать токсические вещества (фумиганты), не
нужно производить измерения растворимых соединений С и N.
Меньшая трудоемкость при использовании автоматической
установки с IRGA или RESPICOND, возможность использовать
большее число повторностей.
Возможность определять микробную биомассу параллельно с
базальным дыханием на той же установке.
Недостатки СИД по сравнению с биоцидными методами
–
Нельзя определить N, P и S в микробной биомассе.
–
Нельзя определить изотопный состав микробной биомассы.

44. Метод СИД (SIR)

Пересчетный коэффициент:
Распространенной ошибкой является использование
коэффициента 30 для расчетов, в которых величина х
уже приведена к размерности мкг СО2-С/(г * ч). В этом
случае происходит занижение расчетной величины
микробной биомассы почти вдвое: фактически нужно
подставлять пересчетный коэффициент 56.

45. Важнейшее следствие недоразумений с пересчетными коэффициентами в FE, FI и SIR:

В ряде публикаций величины микробной биомассы,
полученные методом СИД (SIR), оказывались ниже
таковых, полученных фумигационным или
регидратационным методами. Это – следствие
несовершенства методик определения пересчетных
коэффициентов!
На этом основании, а также в связи с тем, что в методе
СИД (SIR) определяется дыхательная активность
микробного сообщества, некоторые авторы до сих пор
утверждают, что метод СИД (SIR) определяет «активную
микробную биомассу». Это – ошибка!!! И биоцидные
методы, и СИД (SIR) предназначены и откалиброваны для
определения одного и того же пула – общей микробной
биомассы.

46. Главная проблема при использовании любых методов определения микробной биомассы в почве :

Определение пересчетного
коэффициента !!!

47. Кинетический метод – kinetics of substrate-induced response (KSIR)

Принцип метода:
В почву вносят глюкозу и определяют динамику выделения
СО2 в течение 16 – 24 ч после внесения легкодоступного
субстрата (Panikov & Sizova, 1996). Общая и активная
микробная биомасса, а также удельная скорость роста
рассчитываются с использованием уравнений
экспоненциального роста. Определения скорости
выделения СО2 производятся в динамике (оптимально – не
реже 1 раза в час) аналогично тому, как это делается в
методе СИД (SIR).

48. Кинетический метод – kinetics of substrate-induced response (KSIR)

Определяемые
параметры:
Уравнения:
vC – скорость продуктивного
дыхания; vU – скорость
)
непродуктивного
дыхания;
µmax – максимальная
удельная скорость роста
v(t) = vu + vc ×exp(µmax×t)
(1),
где v(t) – скорость продукции CO2;
t - время
r0 – фракция «активной»
микробной биомассы
r0= (vC ×0.1)/( vU + vC ×0.1)
(2)
x0=(vC × 0.9 × Yx/p)/(r0 × µmax)
(3),
x0 - общая микробная
биомасса
x’ – «активная» микробная
биомасса
где Yx/p– экономический
коэффициент
x’ = x0 × r0
(Panikov & Sizova, 1996)
(4)

49.

Typical curve of CO2 emission - KSIR method
200
VCO2, mkgCg-1h-1
150
100
50
0
0
5
10
hours
15
20
25

50. Кинетический метод – kinetics of substrate-induced response (KSIR)

Преимущества KSIR перед другими методами определения микробной
биомассы
+ Определение не только общей, но и активной микробной биомассы.
+ Определение параметров микробной кинетики, что особенно важно при
моделировании микробного роста в почве.
+ Большая чувствительность по сравнению с СИД при определении быстрой
динамики микробной биомассы в почве и ризосфере.
+ Не требуется дополнительных лабораторных манипуляций по сравнению с
СИД – кинетику выделения СО2 можно изучать в тех же пробах.
Недостатки KSIR по сравнению с другими методами определения
микробной биомассы
– Привлечение довольно сложного математического аппарата, высокая
трудоемкость расчетов.
– Параметры µmax и vc часто бывают скоррелированными между собой –
результаты расчетов микробной биомассы поэтому получаются не
свободными от субъективизма исследователя.
– Использование фиксированных значений коэффициента CNрезистентного дыхания и экономического коэффициента Y.
– Отсутствие апробации на широком ряде почв и экосистем.

51.

Методы СИД (SIR) и кинетический (KSIR)
Как это выглядит (определение на установке с IRGA):
Технический Университет г. Инсбрук, Австрия

52.

Методы СИД (SIR) и кинетический (KSIR)
Как это выглядит (определение на установке RESPICOND):
Институт почвенной экологии,
Научн.-иссл. центр Гельмгольцевского общества, Нойерберг/Мюнхен, Германия

53.

Название метода
Принцип
получения
аналитического
сигнала
Фумигационный
БИОЦИДНЫЕ
БИОЦИДНЫЕ
МЕТОДЫ
МЕТОДЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ДЫХАТЕЛЬНОГО
ОТКЛИКА
метод
Регидратационный
метод
Метод
СИДСИД
Кинетический
СИД
метод
АТФ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
БИОМАРКЕРОВ
ЖКФ
ДНК и РНК
Возможности метода
Пригодность для
измерений внутрисуточной
динамики
Низкая трудоемкость
определений
Высокая степень
автоматизации измерений
Ненужность сложного
оборудования для «мокрой
химии»
Совместимость с
изотопными методами
Определение
таксономической
структуры микробного
сообщества

54. Илья Витальевич Евдокимов

Евдокимов И.В. Методы определения биомассы
почвенных микроорганизмов // Russian Journal of
Ecosystem Ecology. 2018. Т. 3. № 3. С. 1-20. DOI:
10.21685/2500-0578-2018-3-5, Q4.
Илья Витальевич Евдокимов
Контакты:
[email protected]
[email protected]

55. БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!