Основные типы повреждений, которые удаляются посредством BER (большая часть не блокирует репликацию)

7.50M

Category:

biology

Репарация ДНК

Причины появления
повреждений в ДНК
Повреждение ДНК – любое изменение ДНК,
которое вызывает отклонение от двуцепочечной
структуры
• Ошибки репликации
• Повреждения ДНК эндогенными агентами
гидролиз
(депуринизация, дезаминирование)
• Повреждения ДНК экзогенными агентами
облучение
повреждение химическими агентами
(например, алкилирование)
• Репликация «через повреждения» с
использованием полимераз, отличающихся
низкой точностью копирования
2

3.

Типы повреждений ДНК
На уровне одного нуклеотида
• Отсутствие основания
• Некомплементарное основание
• Основание с нарушенной структурой
Структурные
• Одноцепочечные разрывы
• Неспецифические связи между цепями
• Двухцепочечные разрывы
3

4.

Репарация ДНК
4

5.

Репарация ДНК
Основные места повреждений
гидролиз
метилирование
окисление
5

6.

Гидролиз
Спонтанная
депуринизация
GUANIN
depurinated
sugar
CYTOSINE
Дезаминирование
GUANIN
URACYL

7.

Дезаминирование
основание
мутаген
(азотистая кислота)
модиф.
основание
партнер по мутагенный
спариванию эффект

8.

Алкилирование
этилметансульфонат
(EMS)
8

9.

Образование тиминовых димеров
под действием УФ-света
O
O
HN
O
O
UV
HN
N
N
N
O
O
HN
O
NH
Циклобутановый
пиримидиновый
димер
Изгиб ДНК 7-9°
O
N
Пиримидин-6-4пиримидинон
Изгиб ДНК 44°
75%
25%
HN
O
O
O
N
OH
HN
O
NH
O
N
N
O
N
N
O
9

10.

Тиминовые димеры изменяют
структуру ДНК
10

11.

Репарация ДНК
повреждения ДНК
объемные (bulky)
несколько повреждений,
расположенных рядом,
межнуклеотидные сшивки,
в том числе,
циклобутановые димеры
точечные (non-bulky)
повреждения единичных
нуклеотидов (гидролиз,
дезаминмрование,
алкилирование и т.д.)
11

12.

Репарация ДНК
Стратегии коррекции повреждений
• Ошибки репликации:
исправление ошибок ДНК полимеразой (3’-5’
экзонуклеаза),
репарация неспареных оснований (mismatch repair)
• Повреждение ДНК эндогенными и
экзогенными агентами:
• Прямое удаление повреждений
• Вырезание (эксцизия) оснований (base excision repair)
• Вырезание (эксцизия) нуклеотидов (nucleotide excision
repair)
• Рекомбинация
• [Черезблоковый синтез особыми полимеразами (не
удаляет ошибок но позволяет продолжить репликацию)]
12

13.

Репарация ДНК
Пути репарации ДНК
1.Прямое исправление повреждений (Direct reversal) (2 и >)
2. Эксцизионная репарация оснований (Base excision repair
(BER)) (15)
3. Эксцизионная репарация нуклеотидов (Nucleotides excision
repair (NER)) (28)
4. Репарация неправильно спаренных нуклеотидов (Mismatch
repair (MMR)) (11)
5. Синтез через повреждения (СОС-ответ) (Trans-lesion
synthesis (SOS-response))
6. Репарация при помощи рекомбинации (Repair via
recombination) (14)
7. Репарация двойных разрывов (Double strand break repair)
(5)
13

14.

15.

Репарация ДНК
прямое исправление повреждений –
фотореактивация
• ДНК-фотолиазы, мономерные флавин-зависимый
ферменты
• Кофакторы : FADH- и 5,10-метенилтетрагидрофолат
(5,10-MTHF)
• Фотолиаза связывается в темноте с димерами ТТ
• На свету кофактор (5,10-MTHF) абсорбирует фотон и
передает энергию возбуждения на FADH• Возбужденный FADH- отдает электрон
пиримидиновому димеру, устраняя повреждение
• Фотолиаза освобождает ДНК
В клетках млекопитающих не найдены!
15

16.

Репарация ДНК
прямое исправление повреждений –
фотореактивация
“antenna”
8-hydroxy deazaflavin
FAD
T-T
dimer
16

17.

Репарация ДНК
Алкилирование нуклеотидов
17

18.

Репарация ДНК
прямое исправление повреждений –
О6-метилгуанин метил трансфераза
GC AT
TA CG
Ada (E.coli)
SN2 mechanism
18

19.

Репарация ДНК
прямое исправление алкилированных
нуклеотидов
19

20.

Репарация ДНК
Алкилирование нуклеотидов
20

21.

Репарация ДНК
прямое исправление алкилированных
нуклеотидов
•Оксидоредуктазы: Alk B (E.coli), hABH2 и hABH3 (Human)
относятся к кетоглутарат/Fe(II)-зависимому суперсемейству диоксигеназ,
в процессе репарации протекает совместно декарбоксилирование
кетоглутарата и окислительное деметилирование поврежденного
основания
•Субстрат: 1meA, 3meC
21

22.

Репарация ДНК
прямое исправление алкилированных
нуклеотидов
22

23.

Репарация ДНК
Алкилирование нуклеотидов
23

24.

Репарация
алкилированых нуклеотидов
ДНК-гликозилаза AlkA
24

25.

26.

Репарация ДНК (BER)
• Различные ДНК-гликозилазы
адресно узнают поврежденные
основания и удаляют их,
разрезая гликозидную связь.
При этом возникает AP
(апуриновый/апиримидиновый)
сайт.
• В клетке существует несколько
АР эндонуклеаз, которые
разрезают фосфодиэфирный
остов ДНК рядом с AP сайтом
• AP нуклеотид удаляется
экзонуклеазой/дезоксирибофос
фодиэстеразой и «брешь»
застраивается ДНК
полимеразой
26

27.

Репарация ДНК
ДНК гликозилазы «выворачивают» модифицированное основание
наружу и отщепляют его от сахарофосфатного остова

28.

Репарация ДНК (ДНК-гликозилазы)

29. Основные типы повреждений, которые удаляются посредством BER (большая часть не блокирует репликацию)

• Окисленные основания, в том числе 8-oкси-G,
который спаривается с А, вызывая GC --> TA
трансверсии
• Дезоксиурацил
• Различные продукты алкилирования оснований
(например, 3-meA)
• Спонтанно возникающие апуриновые сайты

30.

Репарация ДНК
(субстраты BER)
30

31.

Репарация ДНК (BER)
Монофункциональные
ДНК-гликозилазы
расщепляют Nгликозидную
связь с
модифицированным
основанием и приводят
к образованию АРсайта.
Бифункциональные
ДНК-гликозилазы
кроме расщепления Nгликозидной
связи с
модифицированным
основанием способны
удалять 3'-фосфатную
группу путем бетаэлиминирования,
образуя в ДНК
одноцепочечный
разрыв.
Некоторые
бифункциональные
ДНК-гликозилазы
способны
осуществлять вторую
реакцию бетаэлиминирования,
приводящую к
разрыву связи с 5'фосфатной группой.
31

32.

Репарация ДНК (BER)
Все три варианта продуктов ДНК-гликозилаз являются субстратами
апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы, которая путем гидролиза
фосфодиэфирной связи, расположенной с 5′-стороны от АР-сайта,
вносит разрыв в рибозофосфатный остов, либо удаляет оставшийся
дезоксирибофосфатный остаток, или фосфатную группу. В результате
действия АР-эндонуклеазы на 3'-конце разрыва образуется
гидроксильная группа.
32

33.

Репарация ДНК (BER)
На следующих этапах по этому 3'-концу происходит присоединение
комплементарного нуклеотида репарационными ДНКполимеразами, и, затем, ДНК-лигаза заканчивает процесс,
восстанавливая целостность дезоксирибофосфатного остова.
33

34.

Репарация ДНК (NIR)
Некоторые AP эндонуклеазы
(например, APE1) могут
работать как сенсор
повреждений. Помимо AP
сайтов они узнают ряд
других повреждений, в том
числе окисленные
основания.
Эта активность важна для
альтернативного пути
репарации единичных
повреждений (nucleotide
incision repair, NIR).
Преимущество:
нет апуринового сайта,
который сам по себе может
быть опасным для клетки
34

35.

Репарация ДНК (BER)
роль белка PARP1 (Поли(АДФ-рибоза)-полимераза 1)

36.

Поли(АДФ-рибоза)-полимеразы
катализируют поли-АДФ-рибозилирование
NH2
O
N
NH2
N
O
+
O
P O
O
O-
O
N
N
N
O
P O
O-
NH2
N
O
O
P O
O
O
HO OH
HO OH
O
-
N
P O
O-
O
NH2
N
N
O
HO O
HO OH
N
O
O
O
NH2
HO OH
N
O
O
O
P O
O
HO OH
O
-
P O
O-
N
O
N
NH2
N
N
O
HO O
O
O
O
P O
O-
P O
O-
N
O
N
N
HO
HO O
NH2
N
O
O
O
P O
O-
HO OH
O
P O
O-
N
O
HO
N
N
O
P O
-
P O
O
N
O
HO
N
N

37.

Репарация ДНК
роль белка PARP1

38.

39.

Репарация ДНК (NER)
Используется для коррекции «серьезных»
повреждений, которые блокируют репликацию
(например, у человека – тиминовые димеры).
1. Специальные белки узнают поврежденные
участки ДНК и привлекают
специальные нуклеазы, которые вносят разрывы на
некотором расстоянии перед повреждением и на
некотором расстоянии после него.
2. Фрагмент ДНК, содержащий повреждение,
удаляется, и образовавшаяся брешь застраивается
ДНК полимеразой
39

40.

Репарация ДНК (NER)

41.

Репарация ДНК
NER в клетках E. Coli : UvrA, UvrB, UvrC, UvrD
UvrB
UvrA
ADP
1. UvrA и UvrB сканируют
ДНК и выявляют
ATP
UvrC
поврежденные места
UvrD
2. После выявления поврежденного участка
8 nа. UvrB
4-5 n.
UvrA освобождается из комплекса,
вызывает локальную денатурацию
поврежденного участка и привлекает UvrC
ligase
UvrB
UvrC
DNAP I
41

42.

Репарация ДНК
NER в клетках E. Coli : UvrA, UvrB, UvrC, UvrD
3. Комплекс UvrBС вносит однонитевые разрывы с 5’- и 3’- конца от
повреждения.
UvrB
UvrBфрагмента
4. DNA-хеликаза UvrD обеспечивает
удаление из дуплекса
UvrA
ДНК, содержащего повреждение.
5. DNA Pol I застраивает брешь и лигаза «зашивает» однонитевой
разрыв.
UvrC
ADP
ATP
UvrC
UvrD
8 n.
4-5 n.
ligase
DNAP I
42

43.

Репарация ДНК
NER в клетках E. Coli : UvrA, UvrB, UvrC, UvrD
Практически вся эксцизионная репарация в клетках
E.coli проходит за счет UvrABC
В 99% случаев длина «заплатки» 12 н.о. –
ремонт короткими «заплатками»
1% – примерно 1500 н.о. (бывает > 9000 н.о.) –
ремонт длинными «заплатками»
43

44.

Репарация ДНК
NER в клетках E. Coli : UvrA, UvrB, UvrC, UvrD
При повреждении ДНК в первую очередь
репарируются транскрибируемые участки:
Белок Mfd (TRCF)
1. распознает остановившуюся РНК-полимеразу,
2. вытесняет ее из комплекса
3. привлекает на место повреждения UvrAB
Mfd = TRCF
TRCF
UvrA
RNAP
Mutation Frequency Decline (Mfd)
=Transcription Repair Coupling Factor (TRCF)
44

45.

Репарация ДНК
NER в эукариотических клетках
Основной принцип NER в клетках эукариот такой же, как и в
бактериальных: репарируются крупные повреждения,
полученные под действием УФ-света, сшивающих агентов,
химических канцерогенов, путем вырезания фрагмента ДНК
Два пути NER:
1. Система глобальной геномной репарации (GG-NER)
2. Репарация ДНК, связанная с транскрипцией (TC-NER)
Нарушения работе NER ведут к серьезным заболеваниям.
Пигментная ксеродерма (Xeroderma Pigmentosum) (XP)
рецессивное заболевание, семь генов (XPA-XPG)
1-4 случая на 1 000 000 человек
чувствительность к солнечному свету, особенно к УФ,
дефекты в работе ранних этапов NER
45

46.

Репарация ДНК
GG-NER в эукариотических клетках
a, b) Белок XPC в комплексе c HR23B
и цетрином 2 распознает повреждение
c) и привлекает фактор транскрипции
TFIIH, который за счет хеликазной
активности расплетает двойную
спираль ДНК. TFIIH – большой
комплекс, в состав которого входят XPB
(хеликаза и АТФ-аза, расплавляет
промотор при транскрипции) и XPD
(хеликаза, необходимая для репарации)
d, e) Эндонуклеазы XPG (=FEN1) и XPF
вносят разрывы с двух сторон
f) поврежденный участок (25-30
нуклеотидов) замещается за счет
синтеза. Одноцепочечный разрыв
зашивает лигаза.
46

47.

Репарация ДНК
TC-NER в эукариотических клетках
a) Транскрипционный комплекс
остановился на повреждении. TFIIH уже
в его составе, поэтому репарация
транскрибируемых участков идет с
большей эффективностью
b, c) Белки CSA и CSB распознают такую
остановку и освобождают поврежденное
место от полимеразы
d) Выбор пути репарации
e) Возвращение полимеразы и
продолжение транскрипции
47

48.

49.

Репарация ДНК (MMR)
ДНК полимеразы (даже те, у которых есть
корректирующая активность) все равно делают
ошибки, которые надо исправлять
Система репарации ошибок репликации должна
1. Быстро находить ошибки
2. Различать родительскую и новосинтезированную
цепь с тем, чтобы в неспаренном участке
заменить ошибочно включенный нуклеотид
49

50.

Репарация ДНК (MMR)
В клетках E. Coli
MutS2
MutS2
MutL
MutS2
MutL
MutH
DNAP
1. MutS2 сканирует ДНК. Ошибки индуцируют нарушения
в III
UvrD
правильной структуре двойной спирали.
2. Найдя ошибку, MutS2 изменяет конформацию, что закрепляет
ligase
его на цепи ДНК.
Exo
3.В комплекс привлекается 2 молекулы MutL. MutS2L2
протягивает ДНК до обнаружения метилированного сайта GATC
4. Узнавание метилированного GATC заставляет эндонуклеазу
MutH связаться с MutS2L2.
50

51.

Репарация ДНК (MMR)
В клетках E. Coli
MutS2
MutS2
MutL
MutS2
MutL
MutH
DNAP III
UvrD
ligase
Exo
5. MutH разрезает неметилированную цепь.
6. Фрагмент ДНК от сайта метилирования до ошибочного
основания вырезается экзонуклеазами при поддержке хеликазы
UvrD
7. ДНК-ролимераза III застраивает брешь, лигаза зашивает
51
одноцепочечный разрыв.

52.

Репарация ДНК (MMR)
В клетках эукариот
MSH2°MSH6
or
MSH2°MSH3
PMS2°MLH1
nick is 3'-end of
replication intermediate
(Okazaki or leading)
No MutH
homolog
гомологи MutS (MSH — MutS homolog) образуют два
гетеродимерных комплекса
-- MSH2-MSH6 (MutSα) узнает неспаренные нуклеотиды
и короткие «инделы»
-- MSH2-MSH3 (MutSβ) узнает длинные «инделы»
52

53.

Репарация ДНК (MMR)
Эксперименты по связыванию с ДНК in
vitro и репарации гетеродуплексов in vivo
показали, что MMR узнает все комбинации
неспаренных оснований, кроме C:C, а также
короткие <4 п.н. делеции и инсерции
(«инделы»)
Неправильные пары G:T and A:C и
инсерции/делеции в 1 п. особенно хорошо
узнаются. Эти нарушения являются
наиболее частыми ошибками ДНКполимераз
53

54.

55.

Репарация ДНК
SOS ответ в клетках E.coli
Прежде всего об остановке репликации надо сообщить
Rec A
Связывается с однонитевой
ДНК и образует ДНКбелковые филаменты
Однонитевые участки ДНК
образуются при остановке
репликативных вилок
Участвует в рекомбинации
и индукции SOS ответа
Lex A (репрессор)
Мастер-регулятор транскрипции
генов, кодирующих участвующие
в репарации повреждений ДНК
белки (31 ген или более)
Димеры Lex A связываются с
SOS боксами (20 п.н. консенсусы)
в операторах генов репарации и
ингибируют транскрипцию

56.

Репарация ДНК
SOS ответ в клетках E.coli
Прежде всего об остановке репликации надо сообщить
RecA
RecA*
RecA binds ssDNA and
transforms to an activated form (RecA*)
RecA function is hybridization
of 3'-overhang with dsDNA
ATP
RecA*
RecA*

57.

Репарация ДНК
SOS ответ в клетках E.coli
Активированный RecA* разрезает LexA
LexA
genes encoding
SOS response
components
LexA
RecA*
genes encoding
SOS response
components
LexA

58.

Репарация ДНК
SOS ответ в клетках E.coli
Среди прочих в ответ на индукцию SOS-ответа синтезируется ДНКполимераза V, способная синтезировать ДНК через повреждения
RecA*
UmuD
• UmuD повергается автопротео-
UmuD’
UmuD’2UmuC
Pol V
литическому расщеплению с
образованием активного фрагмента
UmuD’, который
• активирует черезблоковую
полимеразу UmuC
• комплекс (UmuD’)2-UmuC называют
ДНК полимераза V
• она осуществляет репликацию через
AP сайты, тимидиновые димеры и ряд
других повреждений
Pol V - translesion
DNA synthesis

59.

Репарация ДНК
SOS ответ в клетках эукариот
В эукариотических клетках система синтеза ДНК через
повреждения активируется в остановившейся репликативной
вилке моноубиквитинированием PCNA
Rad6/Rad18
Ub
PCNA
Rad5/Mms2
Ub
activation of
Y-family DNAP
(z,h,i,k)
translesion
synthesis
repair by
recombination

60.

Эукариотические ДНК
полимеразы
АР сайты
(встраивает А)

61.

Различные системы репарации могут до
известной степени заменять друг друга

62.

Репарация ДНК
Еще один способ обхода препятствия – посредством смены
матричных цепей (продолжение репликации с сохранением
ошибки в одной из родительских цепей
ATR,
SMARCAL1
chicken
foot

63.

64.

Репарация ДНК
Репарации при помощи рекомбинации
Для репарации двунитевых разрывов с использованием
системы гомологичной рекомбинации необходимы
Донор гомологии
(например гомологичная хромосома или сестринская хроматида)
Белок, облегчающий инвазию цепи, и другие компоненты системы
гомологичной рекомбинации
64

65.

Репарация ДНК
Репарации при помощи рекомбинации
Процессирование концов экзонуклеазами;
Создание выступающих 3’-концов
Инвазия 3’-конца первой цепи
Инвазия 3’-конца второй цепи
и репаративный синтез
Миграция ветвей с последующим образованием
классической структуры Холидея
65

66.

Репарация ДНК
Репарации при помощи рекомбинации
Chi
RecBCD
helicase
nuclease
3'exo
5'exo
Interaction with Chi site
inhibits 3' exo and
stimulates 5' exo
Chi
RecA*
“altered”
RecBCD
loads RecA
5'exo
5’GCTGGTGG3’
3’CGACCACC5’
до 10 000 п.н.
66

67.

Репарация ДНК
Репарации при помощи рекомбинации
RecA*
67

68.

Репарация ДНК
Репарации при помощи рекомбинации
участок гомологии
SS
DS
22.13
68

69.

Репарация ДНК
Репарации при помощи рекомбинации
69

70.

71.

Репарация двунитевых разрывов
Двунитевые разрывы в ДНК возникают:
• под действием ионизирующего излучения
• под действием некоторых химических агентов, в
частности, ингибиторов ДНК топоизомеразы II
Существует два основных пути репарации
двунитевых разрывов:
• гомологичная рекомбинация
• негомологичное соединение концов ДНК
71

72.

Репарация двунитевых разрывов
S or G2 phase
(sister chromatide available)
Homologues
recombination
(HR)
G1 phase
Non homologous
end joining
(NHEJ)
Выбор пути определяется, в том числе, процессингом концов.
Удаление даже нескольких нуклеотидов подавляет NHEJ.
Cdk 1, которая отключается в G1-фазе и активна в S и G2 фазах,
фосфорилирует нуклеазу Sae2, которая запускает подравнивание
концов
72

73.

Репарация двунитевых разрывов
Негомологичное соединение концов ДНК
ends protection
Ku80
Ku80
Ku70
Ku80
Ku70
Ku70
DNA-PK
inhibition of replication
and transcription
Ku80
Ku70
DNA PK
PNK
p
p
ligase IV,
XRCC4,
Xlf
Распознавание двунитевого
p
разрыва гетеродимерным
p
белком Ku70/Ku80 –детектором
DNAP
разрыва и платформой
для filling missing
DNAP
Artemis
сборки комплекса
nucleotides
p
TDP1
ДНК-зависимая протеинкиназа
p
DNA-PK
аутофосфорилируется
removal of
damaged
и фосфорилирует ряд белков,
DNA
необходимых далее
73

74.

Репарация двунитевых разрывов
Негомологичное соединение концов ДНК
ends protection
Ku80
Ku80
Ku70
Ku80
Ku70
Ku70
DNA-PK
inhibition of replication
and transcription
Ku80
Ku70
ligase IV,
XRCC4,
Xlf
p
DNA PKразрыва для создания свободных
Обработка концов
p 3'-гидроксильной
и 5'-фосфатной групп (нуклеазы)
DNAP
PNK
p
DNAP filling missing
nucleotides
p
Artemis
TDP1
p
p
removal of damaged
DNA
74

75.

Репарация двунитевых разрывов
Негомологичное соединение концов ДНК
Восстановление
двуцепочечной
структуры ДНК
ends
protection
(полимеразы
Ku80
Ku80 лямбда и мю)
Лигирование (ДНК-лигаза IV и кофактор XRCC4)
Ku70
Ku80
Ku70
Ku70
DNA-PK
inhibition of replication
and transcription
Ku80
Ku70
DNA PK
ligase IV,
XRCC4,
Xlf
p
p
DNAP
DNAP filling missing
nucleotides
p
PNK
p
Artemis
TDP1
p
p
removal of damaged
DNA
75

76.

Репарация ДНК
Репарации двунитевых разрывов
76

77.

Репарация ДНК (BER)
HO O
P
O
O
O
OH
O
...O O
P
OH
O
...O O
P
O
O
OH
O
HO
O
...
HO O
P
O...
O
O
O
dRP
PUA
p
p
77

Репарация ДНК

29. Основные типы повреждений, которые удаляются посредством BER (большая часть не блокирует репликацию)

78. DNA repair